מאמר שיטה

בדיקת אולפקטומטר ארבע-כיוונית: שיטה להערכת תגובות מרומזות ריח בדרוזופילה

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Lin, C.C., et al. התנהגויות חוש הריח שנבדקו על ידי מעקב ממוחשב אחר דרוזופילה באולפקטומטר של ארבעה רבעים. J. Vis. Exp. (2016).

לזבובי פירות יש מערכת ריח מורכבת, הם יכולים להבחין במאות ריחות ולהשתמש בחוש הריח שלהם כדי לכוון החלטות התנהגותיות. סרטון זה מתאר את בדיקת האולפקטומטר הארבע-כיוונית, שיטה לחקר תגובות התנהגותיות של חוש הריח בזבובים. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לטפל בזבובי בדיקה ומהם השלבים הקריטיים בעת ביצוע הבדיקה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. תגובות התנהגותיות לריחות מושכים ודוחים

  1. הפעל את בקר הטמפרטורה והגדר אותו ל- 25 ° C.
  2. חבר את תאי הריח (בקרת ובדיקת ריחות) על ידי הכנסת הצינורית לשקע של תא הריח ולהתאמת הדחיפה לחיבור בתיבת ההתנהגות.
  3. בדוק את קצב הזרימה בכל רביע באמצעות מד זרימת האוויר כדי לוודא שזרמי האוויר הבקרה והריח שווים ל- 100 מ"ל/דקה.
  4. נקו את זירת הזבובים PTFE ואת לוחות הזכוכית עם 70% אתנול 2-3 פעמים ואפשרו להם להתייבש לחלוטין באוויר (~ 3-4 דקות).
  5. הדביקו את לוחות הזכוכית לזירה בעזרת מלחציים.
  6. העברה טסה ללא הרדמת CO2 לתוך הזירה דרך החור באחד מלוחות הזכוכית. לאחר ההעברה, הניחו רשת עגולה על החור כדי למנוע מזבובים לברוח.
    NOTE: הוכח כי הרדמת CO2 משפיעה על התנהגות דרוזופילה ואין להשתמש בה תוך 24 שעות מניסוי התנהגותי.
  7. הכניסו את הזירה עם הזבובים לתא אטום לאור, חברו את ארבעת זרמי האוויר השולטים על ידי חיבור הצינור המחובר למתקן הדחיפה לחיבור בתיבת ההתנהגות לפינות הזירה, סגרו את דלת התא והמתינו 10-15 דקות כדי לאפשר לזבובים להתאקלם בסביבה החדשה. במידת האפשר, כבו את האורות בחדר שבו מבוצעים הניסויים, כדי למנוע דליפת אור מינימלית אפשרית שעלולה להטות את תוצאת הניסוי.
  8. הפעל ניסוי בקרה של 5-10 דקות, שבו זבובים נחשפים ל -4 זרמי אוויר בקרה.
  9. נתחו את הנתונים באופן מיידי (ראו סעיף ניתוח נתונים בהמשך) כדי לוודא שהזבובים מפוזרים באופן אחיד בזירה, ומדד המשיכה קרוב ל-0. צעד זה חיוני, שכן הוא מוודא שאין מקורות בלתי מבוקרים להעדפה או הימנעות בתוך הזירה (למשל דליפת אור מבחוץ, פיזור טמפרטורה לא אחיד, זירה לא אחידה, זיהום ריח וכו'). אם הזבובים מפוזרים באופן לא שוויוני או שהפעילות המוטורית שלהם נמוכה, השליכו את הזבובים, נקו שוב את הזירה (שלב 1.4) והשתמשו בקבוצה חדשה של זבובים כדי לחזור על הניסוי.
  10. חבר את תא הריח להתקנה על-ידי הפעלת השסתומים התלת-כיווניים או חיבור מחדש של צינורות המחבר.
  11. הפעל ניסוי בדיקה במשך 5-10 דקות ונתח את הנתונים כפי שנדון בסעיף 2 להלן (איור 1). הקלטות ארוכות יותר מ- 20 דקות עלולות לגרום לקבצי נתונים שעשויים להיות קשים לעיבוד חישובי. אם יש צורך בהקלטות ניסיוניות ארוכות יותר, עצור במהירות והפעל מחדש את תוכנית המעקב. התוצאה היא פער של ~10 שניות בין הקלטות ניסיוניות.
  12. השליכו זבובים.
  13. נקו את לוחות הזירה והזכוכית עם 70% אתנול (שלב 1.4) והחליפו את צינורות המחבר בתוך המארז האטום לאור. כדי לזרז את הניסויים, ניתן להשתמש בזירה נקייה חדשה, ולנקות את הזירה המלוכלכת תוך כדי ביצוע ריצות ניסיוניות.
  14. ערכו ניסוי נוסף עם קבוצה חדשה של זבובים, במידת הצורך. אם נערכים מספר ניסויים באותו יום, יש לנקוט משנה זהירות כדי לוודא שלא נשאר במערכת ריח מניסוי קודם. זה בדרך כלל לא בעיה עם ריכוזים נמוכים של ריחות או עםCO2, אבל עבור גירויים מרוכזים מאוד עד 24 שעות פער בין ריצות ניסיוני עשוי להיות נחוץ. בנוסף, ניתן להחליף את כל הצינוריות לאחר צינורות הזרימה אם יש חשד לזיהום ריחני במהלך ניסויי בקרה. השאירו תמיד את האוויר היבש דולק בין הניסויים כדי לשטוף את המערכת ברציפות.

2. ניתוח נתונים

הערה: התוכנה המוצעת לרכישת מעקב אחר זבובים (מפורטת בחומרים), עוקבת אחר זבובים בזמן אמת במהלך הרכישה, ושומרת את חותמת הזמן והקואורדינטות של כל הזבובים שזוהו בפורמט *.dat. פיתחנו שגרת Matlab מותאמת אישית כדי להמיר את הנתונים לפורמט Matlab, ולנתח את הנתונים. דוגמאות קוד מסופקות בחומרים משלימים, אך פרטי היישום יהיו תלויים בתוכנה המשמשת לרכישת נתונים.

  1. טען את הנתונים הגולמיים. צור מסיכה מרחבית שעוקבת אחר קווי המתאר של הזירה והחל את המסיכה על הנתונים הגולמיים כדי להסיר את כל נקודות הנתונים שנמצאות מחוץ לזירה מכיוון שהן מייצגות רעש (איור 2A, Supplementary Code MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
  2. הסר את כל נקודות הנתונים שנעות במהירות נמוכה מ-0.163 ס"מ לשנייה למשך יותר מ-3 שניות, מכיוון שסביר להניח שנתונים אלה הם רעש או שנוצרו על-ידי זבובים שאינם נעים (איור 2B, Supplementary Code TemporalFiltering.m).
  3. הצג באופן חזותי נקודות נתונים נותרות על-ידי התווייתן בבת אחת או כמסלולים בודדים (איור 1, קוד משלים SingleTrajectoryViewer.m).
    NOTE: מיקום גבולות הריח בארבעת השדות תלוי ככל הנראה במספר גורמים, כגון המאפיינים של כל ריח וקצב זרימת האוויר בו נעשה שימוש. לדוגמה, ריחות נדיפים מאוד צפויים למלא את רביע הריח באופן מלא יותר מאשר ריחות פחות נדיפים. לכן, סביר להניח כי כל ריח עשוי להציג גבולות ריח שונים במקצת. השימוש בגלאי פוטויוניזציה למדידת גבולות ריח יכול להיות בעייתי מכיוון שהוא משתמש בוואקום כדי לדגום אוויר מנקודה מסוימת, ובכך משבש את ריכוז הריח באותה נקודה. עם זאת, ניתן להעריך במהירות את גבולות הריח בהתבסס על נתוני התנהגות הזבובים. לדוגמה, גבול ריח המבוסס על עקבות זבובים שהצטברו בתגובה לריחות שונים ניתן לראות בבירור באיור 1, C ו-1D.
  4. חישוב מדד משיכה כדי לקבוע אם ניסויי בקרה אינם מייצרים תגובת העדפה, וגם כדי לגשת לתגובה לגירוי ריחני (או אופטוגנטי). כדי לחשב מדד משיכה (AI), השתמש ב- 5 הדקות האחרונות של פקד או הקלטת בדיקה. כדי לקבל מדד משיכה שנופל בין +1 (משיכה מוחלטת) ל- -1 (דחייה מוחלטת), הנוסחה הבאה משמשת לחישוב AI:
    figure-protocol-1
    כאשר N test הוא מספר נקודות הנתונים ברביע הבדיקה, N control הוא המספר הממוצע של נקודות נתונים בשלושת רבעי הבקרה. מדד זה הוא אינטואיטיבי מכיוון ששום העדפה לא תצוין על ידי ערכים קרובים לאפס. עם זאת, הוא אינו מציין נכונה את החלק היחסי של המספר הכולל של זבובים הנמצאים ברביע הריח. כדי להשיג מדד זה, ניתן להשתמש במדד אחוזים (PI):
    figure-protocol-2
    כאשר N test הוא מספר נקודות הנתונים ברביע הבדיקה, ו- Ntotal הוא המספר הכולל של נקודות נתונים בכל ארבעת הרבעים. נוסחה זו מספקת מדד שנופל בין 0 ל-1, כאשר 0.25 מתאים ללא העדפה התנהגותית (איור 1E ו-2C, Supplementary Code AttractionIndex.m).
  5. הפעל 5-10 חזרות של כל תנאי ניסוי, באמצעות קבוצה חדשה של זבובים עבור כל חזרה. השוו את מדדי המשיכה בין תנאים או מול פקדים באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב (איור 1F, הפונקציה kstest2 ב-Matlab).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: נתונים לדוגמה שנוצרו באמצעות בדיקת ריח של ארבעה שדות. (א) סכמטיות של זירת ארבעת השדות. (B) תגובות ניטרליות נצפות כאשר כל ארבעת הרבעים מכילים רק זילוח אוויר יבש. (C) תגובות משיכה לדילול של 6.25% של חומץ תפוחים מחורר מהרביע העליון השמאלי. (D) התנהגויות דחייה המופעלות על ידי 10% אתיל פרופיונאט. באיור 2B-2D משורטט מסלול יחיד מהנתונים שנרכשו. מעבר צבע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מערכת שילוח אוויר(כמות נדרשת)
צינורות ומחברים
סעפות NPT(F) תרמופלסטיותCole-Parmer, IL, ארה"ב (ארצות הברית)R-31522-311
פטמה מקטין הקס (1/4MNPT->1/8MNPT)McMaster-Carr, IL, ארה"ב5232T3141
אבובים (ID:1/8)McMaster-Carr, IL, ארה"ב5108K4350 ft
אבובים (ID:1/16)McMaster-Carr, IL, ארה"ב52355K41100 ft
אביזרי צינור דוקרניMcMaster-Carr, IL, ארה"ב5117K711 חבילה
אביזרי צינור בלחיצה לחיבורMcMaster-Carr, IL, ארה"ב5779K1024
אביזרי צינור דוקרני (1/4MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, ארה"ב5463K4391 חבילה (10)
אביזרי צינור דוקרני (1/8MNPT->1/8BF)McMaster-Carr, IL, ארה"ב5463K4382 חבילה (10)
אביזרי צינור דוקרני (1/8MNPT->1/16BF)McMaster-Carr, IL, ארה"ב5463ג42 חבילה (10)
אביזרי צינור דוקרני (1/4MNPT->1/4BF)McMaster-Carr, IL, ארה"ב5670K841
תקע ראש משושהMcMaster-Carr, IL, ארה"ב48335K1521
וסת לחץ אוויר, מסנן אוויר ומדי זרימה(כמות נדרשת)
יחידת ייבוש גז מעבדהW A HAMMOND DRIERITE CO LTD, אוהיו, ארה"בדגם: L68-NP-303; מלאי #268401
מסגרות Multitube עבור צינורות זרימה 150 מ"מCole-Parmer, IL, ארה"ב (ארצות הברית)R03215-301
מסגרות Multitube עבור צינורות זרימה 150 מ"מCole-Parmer, IL, ארה"ב (ארצות הברית)R03215-761
צינורות זרימה 150 מ"מCole-Parmer, IL, ארה"ב (ארצות הברית)R-03217-159
מחסנית שסתוםCole-Parmer, IL, ארה"ב (ארצות הברית)R-03218-729
וסת אוויר מדויקMcMaster-Carr, IL, ארה"ב6162K131
שסתומי סולניודAutomate Scientific, ברקלי, קליפורניה02-10i4
בקר שסתום סולנואידValveLink 8.2, Automate Scientific, ברקלי, קליפורניה18 בינואר1
מד זרימה אלקטרוניהאניוולAWM3100V1
DAQ (NI USB-6009, מכשירים לאומיים) ו- Aמכשירים לאומייםNI USB-60091
ספק כוחמכשירי Extech3822001
תאי ריח
צנצנת פוליפרופילן בפה רחב 60 מ"לנלג'ין562118-0002לפחות 5 נדרשים לכל ניסוי, אך נדרש תא נפרד לכל דילול של כל ריחן. ניתן להשיג בחנות מכולות, חלק #635114)
תא ריח זכוכית, 0.25 אונקיותבקבוק קרני שמשLB4Bלפחות 5 נדרשים לכל ניסוי
שסתום "In" לתא ריחSmart Products, Inc., CA, ארה"ב (ארצות הברית)214224PB-0011S000-40741 מחלקים אלה משמש לכל תא ריח, אך יש להחליפם לעתים קרובות
שסתום "אאוט" לתא ריחSmart Products, Inc., CA, ארה"ב (ארצות הברית)224214PB-0011S000-40741 מחלקים אלה משמש לכל תא ריח, אך יש להחליפם לעתים קרובות
טבעת ORT Dygert International, MN, ארה"ב (ארצות הברית)AS568-029 Buna-N O-R1 חבילה (100)
זירת טיסה, מצלמה ותיבות התנהגות(כמות נדרשת)
אופן פעולה וחומר של קופסת מצלמהפלסטיק בין-מדינתי, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)ABS שחור extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 אינץ' רבוע
טפלון לזירת זבובים ותוספות תא ריח, בעובי 3/8 אינץ', 12 אינץ' על 12 אינץ'McMaster-Carr, IL, ארה"ב8545K271
לוחות זכוכית, בעובי 1/8 אינץ', 9 אינץ' x 9 אינץ'McMaster-Carr, IL, ארה"ב8476K1912
בקר תרמואלקטרי בעל פעולה כפולהWAtronix Inc, CA, ארה"ב (ארצות הברית)DA12V-K-01
מערך IR LEDתאורה מתקדמת, רוצ'סטר, VT, ארה"ב (ארצות הברית)AL4554-88024, PS24-TL2 מערכי LED וספק כוח אחד
יחידת מיזוג אווירחנות מלקורMAA280T-121
מערכת הדמיה(כמות נדרשת)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 מ"מ F/1.4) עדשה להרכבה CB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, ניו יורק, ארה"בPEC21211 KP1
כבל חברור CCXC-12P05NB AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, ניו יורק, ארה"בSOCCXC12P05N1
מתאם מצלמה DC-700B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, ניו יורק, ארה"בSODC7001
B+W מסנן IR 40,5 093B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, ניו יורק, ארה"ב65-0724421
TiFFEN 40.5 מ"מ מקטב מעגליאמזון1
מצלמת וידאו IRחזון תעשייתי מקור, פלורידה, ארה"בSony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
ממיר וידאו USBThe Imagingsource, NC, ארה"בDFG/USB2-IT1
iFlySpy2 (תוכנת מעקב אחר זבובים)ג'וליאן בראון, סטנפורד, קלפורניה: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
תוכנת לכידת ICThe Imagingsource, NC, ארה"ב(http://www.theimagingsource.com/)
שונות(כמות נדרשת)
כלי סיבובי DremelDremel, Racine, WI, ארה"ב (ארצות הברית)דרמל 8000-031
מקדחים מצופים יהלום לחיתוך זכוכיתזמין מספקים שונים; MSC industrial Supply Co, מלוויל, ניו יורק906063281

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים