דרוזופילה Y-maze Assay: שיטה להערכת תגובות חוש הריח בזבובים

תקציר

מקור: Simonnet, M. M., et al. בדיקת Drosophila Olfaction עם בדיקת מבוך Y. J. Vis. Exp. (2014).

סרטון זה מתאר שיטה לבדיקת התנהגות גישוש חוש הריח בזבוב הפירות, הנקראת מבוך Y. סרטון הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר ולנהל את הבדיקה.

פרוטוקול

טקסט פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. לפני שמתחילים

1. השתמש במלאי ייחוס איזוגני הנושא פנוטיפים התנהגותיים יציבים וחזקים. אין כלל כללי לבחירת מניה זו, שכן כל הבקרות הפוטנציאליות עשויות לשאת אללי רקע הטרוגניים.
2. השתמש במאמץ בקרה זה כדי לחצות לאחור כל מלאי אחר הדרוש לשלבים מאוחרים יותר. שלב זה מיוצג בדרך כלל על ידי לפחות 5 הצלבות רצופות של נקבה בתולה אחת (כדי לאפשר מעבר אפשרי בין כרומוזומים הומולוגיים) ל-2-3 זכרי ייחוס איזוגניים. שלב זה חשוב כדי ליצור הומוגניות ברקע הגנטי בין הזבובים השונים.
3. שמרו על מלאי דרוזופילה על קמח תירס סטנדרטי (9%), שמרים (10%) ואגר בינוני (1.5%) בתוספת אנטיביוטיקה (0.4% מתיל פארא-הידרוקסי-בנזואט) במחזור אור/חושך של 12 שעות ב-25°C.
4. השיגו ניסויים כימו-סנסוריים בחדר מבוקר טמפרטורה (25°C) תחת אור אדום רחוק (כדי לבטל את תרומתם של רמזים חזותיים, ולהתמקד באותות כימו-סנסוריים). חדשו באופן קבוע את אוויר החדר כדי לאוורר את האזור שבין כל ניסוי.

2. תגובת חוש הריח באמצעות בדיקת מבוך Y

1. הרעיבו את הזבובים במשך 16-18 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס בצינורות זכוכית המכילים מגבת נייר רטובה לפני הבדיקה.
2. חברו מחבר בצורת Y לשני בקבוקוני זכוכית ולבקבוקון פלסטיק קטן יותר (בקבוקון טעינה). השתמש בקצוות פיפטה של 1 מ"ל העוברים דרך פקקי הקצף כדי לחבר את המחבר לשלושת הבקבוקונים, ולקבל מבוך Y אטום היטב. חתכו את הקצוות הצרים של שני קצוות פיפטה (~ 2 מ"מ קוטר, כדי למנוע כל חזרה של הזבוב לאחר שקיבל את החלטתו) כדי ליצור שני בקבוקוני "מלכודת", וקצה גדול של קצה פיפטה אחד כדי ליצור את צינור ה"העמסה" (<מחלקה חזקה = "xfig">איור 1A).
3. ממש לפני חיבור בקבוקוני ה"מלכודת" (איור 1B), הניחו נייר סינון אחד ~6 מ"מ בקוטר בכל בקבוקון. הוסף 40 μl של תמיסת ריח על נייר מסנן אחד, ו 40 μl של הממס המתאים על נייר סינון השני.
4. הכניסו עשרה זבובים בני 4 עד 9 ימים לבקבוקון "העמסה". אין להשתמש בהרדמה CO₂ במהלך העברה זו, שכן יש לה השפעה חזקה על ההתנהגות. במקום זאת, השתמשו בקירור קצר על קרח. מניפולציה נכונה של זבובים מורדמים חשובה כדי להגביל את הלחץ על הנבדקים ככל האפשר.
   1. בצע סדרה של בדיקות מבוך Y ב 25 ° C תחת אור אדום רחוק (באמצעות נורות LED כדי להגביל מקור חימום אפשרי) כדי למנוע גירויים חזותיים ככל האפשר. היזהר להחליף את הכיוונים של מבוכי Y (ריח המכיל צינור משמאל, או מימין, וצינור העמסה מלפנים או מאחור; איור 1C).
   2. המתינו מספר שעות עד שהזבובים יכנסו לבקבוקון המלכודת המכיל את הריח או את הממס. ספירה טסה לאחר 24 שעות כדי להגדיל את ההשתתפות עד יותר מ 80% ולספק את הערך המרבי של מדד הריח (Simonnet, תקשורת אישית).
   3. חשב את מדד הריח המתקבל באמצעות הנוסחה הבאה: (מספר בצינור הריח - מספר בצינור הממס)/המספר הכולל של זבובים טעונים.
5. שטפו את מערך מבוך ה-Y-maze באופן הבא: השרו את המערך המפורק, ב-RBS 35 MD, למשך הלילה. יש לשטוף היטב במי ברז. לבסוף יש לשטוף במים נטולי יונים, ולתת להם להתייבש.

3. ניתוח סטטיסטי של הנתונים

1. בצע בדיקת t, ANOVA חד-כיוונית או ANOVA דו-כיוונית בהתאם לנתונים ולמשתנים.

תוצאות

איור 1: תגובת חוש הריח של גברים הוערכה באמצעות מערך מבוך Y. א) מכשיר מפוצל. ב) מכשיר מורכב. ג) התארגנות במצב עבודה באור אדום רחוק. D) כימות תגובות חוש הריח הגברי כלפי חומצה אצטית (AA) או חומצה פנילאצטית (PAA), שתיהן מדוללות במים מזוקקים (10% v/v) (N=11, המייצגות בסך הכל 110 זבובים). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t המשווה את הנתונים ל-0. 0 פירושו שאין ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
דרוזופילה צינור פוליסטירן	VWR אירופה	734-2255	מבוך Y בגודל 30 x 25 מ"מ
צינור דרוזופילה בורוסיליקט	Dijon verre		95 X 25 מ"מ מבוך Y
פקק קצף	דוטשר	999038	מבוך Y
מחבר בצורת Y	יורופרי	11020605	מבוך Y
100-1,000 קצוות פיפטה μl	קורנינג	4868	חבר את קצות הפיפטה הבאים למחבר בצורת Y. חותכים 2 קצוות פיפטה ב 65 מ"מ מהקצה הרחב, ומחברים את הקצה הצר (עם פתח ~ 2 מ"מ) ל -2 בקבוקוני בדיקה. פתחים אלה יגבילו את פניות הפרסה ברגע שהזבובים ייכנסו לצינורות המכילים את הריחות. חותכים קצה פיפטה אחד ב 35 מ"מ מהקצה הרחב, ולחבר אותו לבקבוקון הטעינה.
נורת לד אדומה רחוק	רובין-לקאק	0RB180238	625-630 ניוטון מטר
חומצה אצטית	סיגמא-אולדריץ'	45725
חומצה פנילאצטית	סיגמא-אולדריץ'	P16621
שמרים	Sensient Flavors שטרסבורג	1018880464
קמח תירס	יורוגרם	Farine de maïs
אגר	קאליס	HP-697-25
מתיל הידרוקסי 4 בנזואט	VWR הבינלאומי	25605293