מיקרו-הזרקה של עוברי דרוזופילה חיים: מסירה מוקדמת של ריאגנטים לעובר המתפתח

תקציר

מקור: Brust-Mascher, I., Scholey, J. M. Microinjection Techniques for Study Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (2009).

סרטון זה מתאר כיצד לבצע מיקרו-הזרקות המעבירות ריאגנטים לעוברי דרוזופילה חיים. חוקרים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להציג תרכובות אקסוגניות כמו חומצות גרעין וחלבונים בשלבים המוקדמים של התפתחות העובר. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר ולבצע את ההליך להזרקה של כל מגיב מסיס - כאן, חלבון פלואורסצנטי לניסויי הדמיה חיים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Brust-Mascher and Scholey, Microinjection Techniques for Learning Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).

מתכונים:

צלחות מיץ ענבים:

• 5.5 גרם אגר בקטו

• 14.5 גרם דקסטרוז או גלוקוז

• 7.15 גרם סוכרוז

• 45 מ"ל תרכיז מיץ ענבים (100% מיץ).

• 204.5 מ"ל גובה₂0

• 625 μl 10N NaOH

מערבבים את כל החומרים ומחממים במיקרוגל עד לרתיחה.
הוסף 2.8 מ"ל תערובת חומצה (תערובת חומצה: 20.9 מ"ל חומצה פרופיונית, 2.1 מ"ל חומצה זרחתית, 27 מ"ל H₂0)

מערבבים ויוצקים על צלחות פטרי 35 מ"מ. תן להתמצק בטמפרטורת החדר במשך יום או יומיים. אם לא מתכוונים להשתמש בצלחות בקרוב, אטמו עם פרפילם ושמרו על טמפרטורה של 4°C (אפשרו לאזן ל-RT לפני השימוש).

משחת שמרים:
ממיסים כפית אחת של שמרים (Sigma YSC2, שמרים מ-Saccharomyces cerevisiae type II) במים ליצירת עיסה סמיכה. הניחו כמות קטנה של מיץ ענבים על כל צלחת מיץ ענבים ממש לפני השימוש.

מאגר הזרקה:

• 150 מ"מ K-אספרטט

• 10 מ"מ K-פוספט

• 20 מ"מ אימידזול, pH 7.2

דבק Heptane:
פותחים סרט דביק כפול ומניחים בבקבוק 100 מ"ל, מוסיפים כ-50 מ"ל הפטאן, אוטמים את הבקבוק ומנדנדים למספר ימים. בעת השימוש, להוסיף heptane אם הדבק הוא עבה מדי.

תא התייבשות:
קחו צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ, הכניסו פנימה חלק אחד של צלחת בקוטר 35 מ"מ כדי ליצור "שולחן" והוסיפו סביבו דרייריט (סידן גופרתי נטול מים) כך שגובה הדרייריט לא יהיה גבוה מה"שולחן" וכסו. הכיסוי עם עוברים יונח על "שולחן" זה להתייבשות לפני ההזרקה. כדאי להשתמש לפחות בחלק מהסימנים לדריריט ולשנות אותו כאשר הוא שינה את צבעו.

פרוטוקול:
פרוטוקול זה יכול לשמש להזרקה של כמעט כל מגיב מסיס לתוך עובר סינציאלי דרוזופילה: לדוגמה, חלבון פלואורסצנטי לתצפית או מעכב חלבון מטרה או שניהם.

1. אוסף עוברים

1. הניחו צלחת מיץ ענבים חדשה על כלוב השכיבה.
2. הסר צלחת זו לאחר שעה, זהו האוסף הראשון של היום ולעתים קרובות הוא לא טוב מאוד. זה יכול להיות מושלך.
3. החליפו את הצלחת כל שעה כדי להמשיך לאסוף עוברים במשך שעה כל אחד.

2. הכנת כיסויים

1. שים כיסוי בגודל 50 x 22 מ"מ בצד אחד של שקופית מיקרוסקופ. הדביקו את ארבע הפינות לשקופית כדי שהיא לא תזוז.
2. בעזרת אפליקטור עם קצוות כותנה, מניחים שכבה אחת של דבק הפטן בשורה אחת על הכיסוי (הדבק לא צריך להיות צמיג וצריך להתייבש תוך מספר שניות, אחרת להוסיף עוד הפטאן).
3. הניחו חתיכת סרט דביק כפול על המגלשה לכיוון הצד של הכיסוי.

3. הכנת עוברים

הערה: יש לצלם עוברים כשעתיים לאחר תחילת האיסוף, לכן התחל את השלבים הבאים המאפשרים מספיק זמן לסיים אותם במסגרת זמן זו.

1. בעזרת מברשת לחה, הרימו בזהירות את העוברים מצלחת מיץ הענבים והניחו על סרט דביק כפול על המגלשה.
2. בעזרת החלק החיצוני של הפינצטה, גלגלו את העוברים על נייר הדבק הדביק הכפול עד שהכוריון (הקרום החיצוני) ייפתח.
3. הרימו את העובר על ידי גלגול עדין שלו על הכוריון כך שיידבק לפינצטה והניחו אותו על דבק הפטן על הכיסוי, כאשר הצד הארוך של העובר מקביל לצד הארוך של הכיסוי. הגדר 10 עד 20 עוברים בשורה אחת.
4. הסר את הכיסוי והניחו אותו בתא התייבשות למשך 3 עד 8 דקות (זה תלוי בלחות החדר ובכמות שיש להזריק).
5. מניחים על תא מתכת עם שומן ואקום.
6. כסו את העוברים בשמן הלוקרבון 700 כדי למנוע התייבשות נוספת. העוברים מוכנים כעת לזריקה.

4. הזרקת עובר

1. מצא את העוברים תחת יעד של פי 16.
2. הרחיקו את העוברים, ומצאו את המחט מבלי להזיז את מישור המוקד.
3. מרכז את המחט והזז אותה למעלה מבלי להזיז אותה בכיוון x או y.
4. אם המחט אינה פתוחה, הניחו את קצה הכיסוי בשדה הראייה, אך לא במקום שבו המחט תהיה, והורידו את המחט לאותו מישור מוקד. בזהירות רבה להזיז את הכיסוי עד שהוא פוגע במחט בעדינות שובר אותו פתוח. אם המחט פתוחה, עבור לשלב 5. (ניתן לפתוח מחטים עם חומצה הידרופלואורית לפני המילוי).
5. שימו את העוברים במבט (אבל לא איפה המחט תהיה), הורידו את המחט לתוך השמן וודאו שאתם מקבלים טיפות נוזל נחמדות מהמחט.
6. בזהירות אך בהתמדה להעביר את העובר לתוך המחט ולהזריק טיפה לתוך העובר ולהרחיק את העובר. (או בצע את ההוראות של מכשיר ההזרקה שלך).
7. לאחר שכל העוברים הוזרקו, הם מוכנים לתצפית במיקרוסקופ קונפוקלי.