אור ספוט Assay: שיטה לחקור התנהגות פוטוטאקטית Drosophila

תקציר

מקור: שמש, י., ואח '. אור ספוט מבוסס Asssay לניתוח של דרוסופילה Larval Phototaxis. ג'יי ויס אקספ. (2019).

זחלי דרוזופילה רגישים לאור ומגיבים לשינויים באור שמסביב. סרטון זה מתאר בדיקה הבדוקה את יכולתם להימנע מאור, הנקראת בדיקת נקודת האור. הפרוטוקול המוצג מדגים כיצד להגדיר את התסעפות עם נורית אור כחול ומראה כיצד לתעד את התנהגות החיה בתגובה למפגש האור.

פרוטוקול

טקסט פרוטוקול זה הוא קטע מתוך שמש ואח ', אור ספוט מבוסס Assay לניתוח של דרוזופילה Larval Phototaxis, J. Vis. Exp. (2019).

1. הגדרת מערכת ההדמיה

1. מהדקים מצלמת אינטרנט ברזולוציה גבוהה עם קליפ ברזל, בגובה של כ-10 ס"מ מעל נקודת האור בשולחן העבודה (איור 1).
2. כוונן את כיוון עדשת המצלמה לכיוון שולחן העבודה. חבר את המצלמה למחשב באמצעות ממשק USB.
3. הנח צלחת אגר על שולחן העבודה ממש מתחת למצלמה.
4. פתח את תוכנת "Amcap9.22" במחשב עם Windows 7, ואת נקודת האור יוצג באופן אוטומטי בחלון של AMcap. הזז את המצלמה מעט שמאלה או ימינה כדי לוודא שנפוט האור נמצא ליד מרכז החלון. ודא שהמצלמה אינה חוסמת את נתיב האור. נקודת האור צריכה להיות שלמה ועגולה.
   שים לב: התוכנה ניתן למצוא http://amcap.en.softonic.com/.
5. תקן מסנן מעבר פס של 850 ננומטר ± 3 ננומטר עם קליפ ב- 5-7 מ"מ ממש מתחת למצלמה.
   שים לב: קוטרו של המסנן הוא כ-2.5 ס"מ, וקוטרו של עדשת המצלמה פחות מ-1 ס"מ, כך שהמסנן יכול לכסות את שדה הראייה של המצלמה. עם המסנן מתחת למצלמה, אין לראות את נקודת האור בחלון של AMcap.
6. מניחים שלוש נוריות יוצרות אור אינפרא אדום (אורך גל מרכזי = 850 ננומטר) באופן שווה סביב צלחת אגר. כל נורית צריכה להיות במרחק של כ-5 ס"מ מקצה צלחת הגר, ופני העדשה של הנורית צריכים להיות בזווית של 70 מעלות כלפי מטה לכיוון צלחת הגר. חבר את נוריות ה- LED לחשמל באמצעות ממיר AC-ל- DC.
   שים לב: עדיף לתקן את המיקומים והזוויות של נוריות אור אינפרא אדום כדי להבטיח עקביות של בהירות השדה בניסויים ניסיוניים שונים להקל על עיבוד וידאו מאוחר יותר.
7. שים לוח שחור בין המחשב להתקן. הגדר את הבהירות של מסך המחשב כדי למנוע מאור המסך של המחשב להשפיע על הניסוי.
   שים לב: שמור על הסביבה כהה בעת מדידת אורך הגל או עוצמת האור.

2. הגדרת פרמטרים של דימות

1. בתפריט של תוכנת AMcap, בחר אפשרויות | | של התקן וידאו לכוד תבניתוהגדר את גודל הפיקסל של הווידאו שנלכד ל- 800 x 600 ואת קצב המסגרות ל- 60 fps.
2. הסר את המסנן מתחת למצלמה, הצב סרגל מתחת למצלמה והתאם את מוקד המצלמה כדי להבהיר את קו קנה המידה ומקביל לרוחב שדה הווידאו של התצוגה.
3. לחץ על | לכידה הגדרת | לכידת וידאו לבחירת נתיב השמירה, לחץ על התחל הקלטה, הקלט את המרחק הממשי המתאים ל- 600 פיקסלים וחשב את היחס בין כל פיקסל למרחק הממשי.

3. הקלטת וידאו של התנהגות הימנעות אור

1. לשמור על טמפרטורה של 25 °C (69 °F) דרך כל הניסויים. בקרה על טמפרטורת החדר עם מזגן במידת הצורך. שמור על הלחות כל הזמן ב 60% עם מכשיר אדים.
2. צלם סרטון קצר של מיקום נקודת האור בשם "lightarea1". לאחר מכן, להזיז את 850 ננומטר ± 3 ננומטר מסנן בחזרה כדי לכסות את עדשת המצלמה.
   שים לב: בעת הקלטת התנהגות הזחל, עדשת המצלמה מכוסה על ידי מסנן 850 ננומטר ± 3 ננומטר, כך נקודת האור אינו מוצג בסרטון. ניתן לשחזר את נקודת האור בסרטונים עם זחלים מאוחר יותר עם Matlab. אל תשנה את מיקום המצלמה, והימנע משינוי היחס בין כל פיקסל למרחק הנמדד בפועל בשלב 2.3.
3. הדליקו אור (כלומר, אור חדר) הרחק מהמכשיר הניסיוני. להנמיך את האור נמוך ככל האפשר, כל עוד הזחלים ניתן לראות בבירור עם העיניים. מוציאים את הזחלים מהמדיום התרבותי עם כפית, בוחרים בעדינות זחל שלישי, ושוטפים אותו במים מזוקקים. היזהר לשטוף זחלים אחד בכל פעם, כדי למנוע הפרעה מרעב. ניסוי אחד דורש לפחות 20 זחלים.
4. מעבירים את הזחל למרכז צלחת הגר הממוקמת מתחת למצלמה במהלך שלב 1.3. יש להסיר בעדינות מים עודפים מהזחל באמצעות מברשת או להשתמש בנייר סופג כדי להסיר מים מהזחל כדי למנוע השתקפות של אור מתחת לעדשה. כבה את אור החדר ואפשר לזחל להתאקלם במשך 2 דקות בסביבה החשוכה.
5. הדליקו את נורית ה-LED כדי ליצור אור אינפרא אדום, וצחצחו בעדינות את הזחל למרכז הצלחת. כאשר הזחל מתחיל לזחול ישר, לסובב את הצלחת כדי להפוך את הזחל ראש לכיוון נקודת האור. ודא שהוא סורק ישירות מההתחלה, אחרת ייתכן שהוא לא יקבל גישה לנקודת האור.
6. לחץ על | לכידה הגדרת | לכידת וידאו כדי לבחור את נתיב השמירה ולאחר מכן לחץ על התחל הקלטה להקלטה. אפשר לזחל לזחול לכיוון נקודת האור, הזן את נקודת האור ולאחר מכן השאר את נקודת האור עד שהיא כמעט מחוץ לשדה הראייה. לחץ על הפסק הקלטה. אם הזחל מתרחק מנקודת האור לפני שהוא מתקרב, לחץ ישירות על עצור הקלטה.
7. הרחק את המסנן מהמצלמה. קח וידאו קצר של המיקום של נקודת האור בשם "lightarea2" ולהשוות אותו "lightarea1" כדי להבטיח כי מיקום נקודת האור לא השתנה. אם נצפה שינוי מיקום ברור, מחק את הנתונים.

תוצאות

איור 1: הגדרה ניסיונית. (A)ייצוג סכמטי של ההגדרה עבור המזחלת המהירה מבוססת כתמי האור. הקווים הכחולים מייצגים את נתיבי האור הנראה המשמשים כגירוי חזותי, והקווים האדומים מייצגים את הנתיבים של אור אינפרא אדום. החצים מציינים את כיוון האור. מסנן מעבר הפס של 850 ננומטר מאפשר לאור אינפרא-אדום לעבור, אך הוא חוסם אור נראה לעין. (B)תמונה של ההגדרה עבור הנקודה האור assay. יש לציין כי התמונה צולמה בתנ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
850 ננומטר ± 3 ננומטר LED מחולל אור אינפרא אדום	Thorlabs, ארה"ב	PM100A	חיישנים תואמים: פוטודיודה וטווח הספק אופטי Thermal : 100 pW עד 200 W טווח אורך גל חיישן זמיןA: 185 nm-25 μ m קצב רענון תצוגה: 20 הרץ רוחב פס: DC-100 קילו-הרץ טווח חיישן פוטודיודה: 50 nA-5 mA טווח חיישן תרמופיל: 1 mV-1 V
ממיר AC ל-DC	Thorlabs, ארה"ב	}S120VC	גודל צמצם: ואוסלאש; 9.5 מ"מ טווח אורך גל: 200-1100 ננומטר טווח הספק: 50 nW-50 mW סוג גלאי: Si Photodiode (UV מורחב) ליניאריות: ± 0.5% אי ודאות מדידה: ± 3% (440-980 ננומטר), ± 5% (280-439 ננומטר), ± 7% (200-279 ננומטר, 981-1100 ננומטר)
	Thorlabs, ארה"ב	DC2100	טווח זרם LED: 0-2 A LED רזולוציית זרם: 1 mA LED דיוק זרם: ± 20 mA מתח LED קדימה: 24 V טווח תדרים של אפנון: 0-100 קילו-הרץ גל סינוס אפנון: שרירותי
אור כחול LED קולימאט	ELP, סין	USBFHD01M	} רזולוציה מקסימלית: 1920x1080 f6.0 מ"מ חיישן: 1/2.7 אינץ' CMOS OV2710
קונסולת מד כוח קומפקטית	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	מידות: 89.1 מ"מ x 63.3 מ"מ x 34.4 מ"מ משקל: 190 גרם גלאי: Sony ILX511B (מערך CCD סיליקון ליניארי 2048 אלמנטים) טווח אורכי גל: 200-850 ננומטר זמן אינטגרציה: 1 ms – 65 שניות (20 שניות אופייניות) טווח דינמי: 8.5 x 10^7 (מערכת); 1300:1 לרכישה בודדת יחס אות לרעש: 250:1 (אות מלא) רעש כהה: 50 RMS counts סורג: 2 (250 – 800 ננומטר) חריץ: SLIT-50 עדשת איסוף גלאי: L2 מיון הזמנות: OFLV-200-850 רזולוציה אופטית: ~2.0 ננומטר FWHM אור תועה: < 0.05% ב-600 ננומטר; < 0.10% ב-435 ננומטר מחבר סיבים אופטיים: SMA 905 עד 0.22 צמצם מספרי סיב חד-גדילי
מנהל התקן LED בעל הספק גבוה	Minhongshi, סין	MHS-48XY	מתח עבודה: DC12V אורך גל מרכזי: 850nm
מצלמת אינטרנט ברזולוציה גבוהה	Thorlabs, ארה"ב	MWWHL4	צבע: לבן חם טמפרטורת צבע מתואמת: 3000 K זרם בדיקה עבור הספק LED טיפוסי: 1000 mA זרם מרבי (CW): 1000 mA רוחב פס (FWHM): N/A הספק חשמלי: 3000 mW זווית צפייה (זווית מלאה): 120° גודל פולט: 1 מ"מ x 1 מ"מ אורך חיים אופייני: >50,000 h טמפרטורת פעולה (ללא עיבוי): 0 עד 40 & deg; C טמפרטורת אחסון: -40 עד 70 & deg; C קבוצת סיכוןa: RG1 – קבוצת סיכון נמוכה
LED לבן חם	}Mega-9, סין	BP850/22K	Ø 25.4 (+0 ~ -0.1) מ"מ < > רוחב פס: 22 & plusmn; 3nm העברת שיא: 80% אורך גל מרכזי: 850nm ± 3nm
ספקטרומטר	נואל דנג'ו	Amcap9.22	AMCap היא אפליקציית לכידת סטילס ווידאו עם תכונות תצוגה מקדימה והקלטה. זהו יישום שולחן עבודה המיועד למחשבים המריצים Windows 7 SP1 ואילך. רוב המכשירים התואמים ל-Video-for-Windows ו-DirectShow נתמכים בין אם מדובר במצלמות אינטרנט זולות או בכרטיסי לכידת וידאו מתקדמים.
חיישן כוח פוטודיודה סטנדרטי	סופר דרקון, סין	YGY-122000	קלט: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A פלט: DC 12V 2A
חיישן כוח תרמי	Thorlabs, USA	M470L3-C1	צבע: כחול אורך גל נומינליa: 470 nm רוחב פס (FWHM): 25 nm זרם מרבי (CW): 1000 mA מתח קדימה: 3.2 V הספק חשמלי (מקסימום): 3200 mW גודל פולט: 1 מ"מ x 1 מ"מ אורך חיים אופייני: 100,000 h טמפרטורת פעולה (ללא עיבוי): 0 עד 40 ° C טמפרטורת אחסון: -40 עד 70 & deg; C קבוצת סיכוןb: RG2 – קבוצת סיכון בינונית
חיישן כוח תרמי	Thorlabs, ארה"ב	S401C	טווח אורכי גל: 190 ננומטר-20 μ m טווח הספק אופטי: 10 μ W-1 ואט (3 Wb) גודל צמצם כניסה: Ø 10 מ"מ שטח גלאי פעיל: 10 מ"מ x 10 מ"מ צפיפות הספק אופטית מקסימלית: 500 W/cm2 (ממוצע) ליניאריות: ± 0.5%