דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל: בידוד איברים אנדוקריניים התפתחותיים מדרוזופילה

תקציר

מקור: Imura, E., et al. פרוטוקולים להדמיית איברים סטרואידוגניים ואיבריהם האינטראקטיביים עם Immunostaining בזבוב הפירות Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את בלוטת טבעת דרוזופילה, מבנה אנדוקריני מורכב החשוב לביוסינתזה ולהפרשת אקדיסטרואידים והורמונים אחרים. הפרוטוקול המוצג מדגים את הדיסקציה, הקיבוע והחיסון.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

הערה: ערכת הפרוטוקולים הכוללת מוצגת באיור 1.

1. דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל (RG)

הערה: ב-D. melanogaster, השייך ל-cyclorrhaphous Diptera, ה-PG נמצא בתוך איבר אנדוקריני מורכב שנקרא בלוטת הטבעת (RG, איור 2D). מאחר שאין זה אפשרי שה-PG מופרד בניתוח מסוגים אחרים של תאים (נדון בהמשך), מטרה מעשית היא לבודד RG שלם ולא פגום על ידי דיסקציה.

1. הכנת הזחלים בשלבי ההתפתחות המתאימים
   NOTE: כדי לסנכרן את שלבי ההתפתחות של זחלי D. melanogaster, יש צורך לאסוף ביצים בחלון זמן צר ולאסוף זחלים בזמנים המתאימים.
   1. לאסוף ביצים במשך 2 שעות על צלחת אגר מיץ ענבים ב 25 ° C.
   2. אספו זחלי כוכב^{1 שזה} עתה בקעו תחת מיקרוסקופ מנתח עם מלקחיים והעבירו אותם לבקבוקון קטן המכיל מחית שמרים סטנדרטיים/מזון זבוב קמח תירס.
      NOTE: גיל הזחלים מיוצג על ידי "שעות לאחר הטלת ביצים (hAEL)", "שעות לאחר בקיעה (hAH)", או "שעות לאחר אקדיזיס L3 (hAL3E)".
   3. בנקודת הזמן המתאימה, אספו את הזחלים המבוימים עם לולאת פלסטיק חד פעמית כדי למנוע פגיעה לא רצויה. כדי למזער את ההבדל בהתקדמות ההתפתחותית של זחלי הכוכב^השלישי, אספו את זחלי הכוכב^השני ב-70 hAEL (48 hAH) ואפשרו להם להתיך במרווחים של שעתיים. לאחר מכן, לאסוף את הזחלים^{instar 3} בתוך 2 שעות לאחר אקדיזיס L3; הליך זה נותן 0-2 זחלי hAL3E.
   4. מעבירים את הזחלים המבוימים לצלחת מלאה במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   5. שטפו את הזחלים עם PBS כדי להסיר שאריות מזון מהגוף.
2. דיסקציה גסה של הזחלים תחת מיקרוסקופ מנתח
   1. החזיקו את וו הפה של הזחל בעזרת מלקחיים. חותכים את גוף הזחל בשליש הקדמי של אורך הגוף באמצעות מספריים מיקרו.
   2. החזק את הקצה החתוך של גוף הזחל הקדמי עם זוג מלקחיים אחד. באמצעות זוג המלקחיים האחרים, לדחוף בעדינות את קצה הראש לכיוון החלק הפנימי של הגוף; הליך זה הופך את גוף הזחל מבפנים החוצה.
      NOTE: ניתן לדלג על שלב זה לדיסקציה של זחלי כוכב^רחוב 1.
   3. חזור על שלבים 1.2.1-1.2.2 עם זחלים נוספים למשך 5-10 דקות.
      NOTE: מספר הזחלים צריך להיות שווה או פחות מ 20 כדי לחסוך זמן דיסקציה.
3. קיבוע והכתמה של רקמה עם אימונוהיסטוכימיה
   1. הכניסו את השליש הקדמי של גופי הזחל (שלב 1.2.2) לתוך מיקרו-צינור של 1.5 מ"ל מלא ב-500 מיקרו-ליטר את תמיסת התיקון (4% פרפורמלדהיד ב-PBS). תקן פחות מ -20 דגימות בו זמנית, אחרת PBS המצורף לדגימות הקבועות עלול לגרום לדילול שלילי של הקיבוע. לדיסקציה של פילה, הסר טיפה של PBS ולאחר מכן הוסף טיפה של fix solution.
      NOTE: לתמיסת תיקון, ניתן להשתמש ב-3.7% פורמלדהיד או ב-4% פרפורמלדהיד.
   2. דגרו על הרקמות המנותחות בתמיסת התיקון למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או לחילופין למשך שעתיים בטמפרטורה של 4°C.
   3. החלף את תמיסת התיקון ב- PBS של 500 μL ושטוף במהירות את הדגימות 3 פעמים. שטפו את הדגימות עם 500 μL 0.3% PBT (PBS + 0.3% octylphenol ethoxylate) במשך 15 דקות על נדנדה ב-RT. לדיסקציה של פילה, הסירו את סיכות החרק והעבירו את הדגימות למיקרו-צינור בנפח 1.5 מ"ל.
      NOTE: להגדלת החדירות של נוגדנים לרקמות, הדגימות מטופלות עם 500 μL 2.0% PBT במשך 1-2 שעות על נדנדה ב RT.
   4. החלף PBT בתמיסת חסימה של 500 μL (אלבומין בסרום בקר 2% ב-PBT). דגרו על הדגימות במשך 1.5 שעות על נדנדה ב-RT.
   5. החלף את הפתרון החוסם ב- 50 μL תמיסת הנוגדנים העיקרית, כלומר נוגדנים מדוללים בתמיסת החסימה.
   6. לדגור את הדגימות לילה על נדנדה ב 4 ° C.
   7. החלף את תמיסת הנוגדנים העיקרית ב- 500 μL 0.3% PBT ושטוף במהירות את הדגימות 5 פעמים. שטפו את הדגימות 3 פעמים עם 500 μL 0.3% PBT במשך 15 דקות כל אחת על נדנדה ב-RT.
   8. החלף 0.3% PBT ב- 50 μL את תמיסת הנוגדנים המשנית (נוגדנים מצומדים בצבע המדוללים בתמיסת החסימה). עבור צביעה גרעינית, 0.5 μL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0.1 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי) מתווסף לתמיסת 50 μL. דגרו את הדגימות על נדנדה במשך שעתיים ב-RT או לחילופין ב-4°C למשך הלילה.
      NOTE: שמור את הדגימות בחושך.
   9. יש להחליף את תמיסת הנוגדנים ב-500 μL 0.3% PBT ולשטוף 5 פעמים. שטפו את הדגימות 3 פעמים עם 500 μL 0.3% PBT למשך 15 דקות כל אחת ב-RT.
4. דיסקציה עדינה של קומפלקס המוח-RG המכיל את PG והרכבה
   1. השתמש פיפט חד פעמי כדי להעביר את הדגימות immunostained לצלחת מלאה 0.3% PBT.
      NOTE: כדי למנוע בועות לא נוחות במהלך דיסקציה והרכבה, ניתן להחליף 0.3% PBT ב- PBS.
   2. תחת מיקרוסקופ מנתח, החזיקו את הקוטיקולה או את וו הפה עם זוג אחד של מלקחיים. באמצעות מחט 27 גרם המחוברת מזרק 1 מ"ל כמו "סכין", לחתוך את הקצה הקדמי של הוושט ואת דיסקי העיניים כדי להסיר את המוח RG-עין דיסק מורכב מן הקוטיקולה הגוף.
   3. להפריד את הוושט ואת המעי מן המוח RG-עין דיסק מורכב עם מלקחיים. מכיוון שהוושט עובר דרך המוח מעל חוט העצב הגחוני (VNC), משוך את המעי לצד האחורי.
      NOTE: כדי להסיר דיסקים דמיוניים נוספים מהדגימות, חתכו את הקשרים בין המוח, דיסקי העיניים ודיסקיות הרגליים בעזרת סכין מחט.
   4. חזור על השלבים 1.4.1-1.4.4 עבור דגימות אחרות.
      NOTE: כדי למנוע הידבקות של פסולת רקמות לדגימות, העבירו כל דגימה שהושלמה לצלחת נקייה אחרת מלאה ב-0.3% PBT או PBS.
   5. מעבירים את הדגימות למרכז שקופית זכוכית נקייה עם מיקרופיפטה.
      NOTE: עבור זחלי כוכב 2^או 3, קצה קצה מיקרופיפטה צריך להיות חתוך עם סכין גילוח.
   6. תחת מיקרוסקופ מנתח, יישרו דגימות בודדות עם הצד הגבי שלהן כלפי מעלה באמצעות מלקחיים.
      NOTE: ה-RG ממוקם בצד הגבי של המוח (איור 2A). יישור זה מאפשר אפיון של דגימות בודדות במהלך ההדמיה.
   7. הטו מגלשת זכוכית ונגבו כמה שיותר PBT עודף. שים טיפה של מגיב הרכבה בצד של השקופית. מניחים את קצה החלקת הכיסוי מהצד השני של הטיפה ומניחים את החלקת הכיסוי על הדגימות באיטיות בעזרת מלקחיים.
      NOTE: הליך זה מונע מהדגימות לנוע מחוץ לחלקת הכיסוי.
   8. אחסנו את הדגימות בטמפרטורה של 4°C. שמרו את הדגימות בחושך.

תוצאות

איור 1: התוכנית הכוללת של פרוטוקולים. שתי שיטות דיסקציה שונות ישימות לזחלים ולנקבות בוגרות, בהתאם למטרת הניסויים. שיטות ההרכבה מתוכננות גם על פי תנאי מדגם. טכניקות קיבוע, צביעה והדמיה משותפות למעשה לכל הדגימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אוסף ביצים
צלחת תרבית רקמות (55 מ"מ)	כאחד	1-8549-02	לצלחות אגר מיץ ענבים
גביע האיסוף	היקארי קאגאקו
ממרח שמרים	שמרים יבשים מזרחיים, טוקיו
100% מיץ ענבים	Welch מזון בע"מ
גידול זחלים
בקבוקונים קטנים (12 מ"ל, 40×23.5 מ"מ, PS)	זארשטדט	58.487
לולאה חד פעמית	כאחד	6-488-01
אוכל זבוב סטנדרטי			המתכון נמצא באתר האינטרנט של מרכז המניות של בלומינגטון.
דיסקציה
מיקרוסקופ מנתח	קרל זיס	סטמי 2000-C
מיקרוסקופ מנתח	לייקה	S8 AP0
צלחת תרבית רקמות (35X10 מ"מ, לא מטופלת)	איוואקי	1000-035
סילגארד	טוראי		ציפוי סיליקון בתוך כלים
מחט Terumo (27G, 0.40 x 19 מ"מ)	טרומו	NN-2719S	"סכין" לחיתוך הרקמה
מלקחיים, אינוקס, #5	Dumont, שוויץ
סיכת חרקים (קוטר 0.18 מ"מ)	מותג שיגה		לדיסקציה של פילה
מיקרו מספריים	NATSUME SEISAKUSHO ושות' בע מ	MB-50-10
קיבוע
מים טהורים במיוחד	מרק מיליפור
מלח חוצץ פוספט (PBS)
פורמלדהיד	Nacalai tesque	16222-65
פרפורמאלדהיד	Nacalai tesque	02890-45
טריטון-X100	Nacalai tesque	35501-15
מיקרו-צינוריות (1.5 מ"ל)	אינה אופטיקה	CF-0150
דגירה
כמערבל סוויסט אחד TM-300 (נדנדה)	כאחד	TM-300	רוקר
אלבומין בסרום בקר	סיגמא	9048-46-8
נוגדן ראשוני
אנטי-סרו (שרקן), 1:1000
נגד GFP (ארנב), 1:1000	בדיקות מולקולריות	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
אנטי-GFP (עכבר mAb, GF200), 1:100	נקראי טסק	04363-66
אנטי-5HT (ארנב), 1:500	סיגמא	S5545
אנטי-HTS 1B1 (עכבר)	מחקרים התפתחותיים בנק היברידיומה (DSHB)	1ב1
אנטי-דה-קדרין (חולדה), 1:20	DSHB	DCAD2
אנטי-NC82 (עכבר), 1:50	DSHB	NC82
נוגדן משני
נוגדן משני נגד ארנב נגד ארנב (H+L), Alexa Fluor 488 מצומד	לייף טכנולוגיות	A-11008
עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 488 מצומד	לייף טכנולוגיות	A-11001
נוגדן משני נגד חולדות מסוג IgG (H+L), Alexa Fluor 546 מצומד	לייף טכנולוגיות	A-11081
עז נגד גינאה חזיר IgG (H+L) נוגדן משני, Alexa Fluor 555 מצומד	לייף טכנולוגיות	A-21435
Alexa Fluor 546 פלואידין מצומד בצבע	לייף טכנולוגיות	A-22283
הרכבת ריאגנטים
זכוכית מיקרו סלייד	Matsunami זכוכית Ind., בע מ	SS7213
זכוכית כיסוי מיקרוסקופ מרובע	Matsunami זכוכית Ind., בע מ	C218181
מגיב FluorSave (מגיב הרכבה)	קלביוכם	345789
פיפטה העברה 1 מ"ל (טפטפת חד פעמית)	ווטסון	5660-222-1S
מניות זבוב
טו; GMR45C06-GAL4			ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			מתנות מק. איטו, אוניברסיטת טוקיו.
W[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
טו; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			לי, H. H. (2014) ו Alekseyenko, O. V, לי, C. & Kravitz, E. A. (2010)
טו; UAS-mCD8::GFP			ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			ממרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה. (#51941)