בדיקת שיפוע טמפרטורה: שיטה לבדיקת העדפת טמפרטורה בזחלי דרוזופילה

תקציר

מקור: Liu, J., et al. A בדיקת שיפוע טמפרטורה לקביעת העדפות תרמיות של זחלי דרוזופילה. J. Vis. Exp. (2018).

זבובי פירות דרוזופילה יכולים להבחין בשינויים קטנים בטמפרטורה ולכן לבחור סביבות עם תנאים תרמיים נוחים. סרטון זה מתאר בדיקה התנהגותית הבודקת את העדפת הטמפרטורה של זחלי דרוזופילה על שיפוע תרמי ליניארי.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Liu et al. בדיקת שיפוע טמפרטורה לקביעת העדפות תרמיות של זחלי דרוזופילה, J. Vis. Exp. (2018).

1. הגדרת שיפוע טמפרטורה

1. הכנת מעבר צבע חד-כיווני
   1. כדי ליצור סביבה לחה במהלך הבדיקה, הניחו את שני גושי האלומיניום המחוברים לשתי אמבטיות מים על מגבות נייר רטובות, המופרדות ב-10 ס"מ (איור 1A).
   2. הפעל את שתי אמבטיות המים ~ 2 שעות לפני תחילת הבדיקה כדי לאפשר מספיק זמן לטמפרטורה של בלוקי אלומיניום לאזן.
      NOTE: מומלץ לבצע ניסוי דמה כדי לקבוע את הטמפרטורה של כל אמבט מים הדרוש להשגת שיפוע הטמפרטורה הליניארי הרצוי. כמה זוגות טמפרטורות אופייניים להגדרת אמבטיות המים מפורטים בטבלה 1. עם זאת, שימו לב שטמפרטורות פני השטח מושפעות מטמפרטורת הסביבה. אורך הצינור משפיע גם על הטמפרטורות מכיוון שיש קירור בצינורות. אורך הצינור במערך שלנו הוא 1.5 מ '.
   3. יש לחמם במיקרוגל 100 מ"ל של 1% אגרוז בעוצמה גבוהה בבקבוק עגול רחב פה של 500 מ"ל ולשפוך 25 מ"ל/צלחת בדיקה על ספסל ישר. הכינו שתי לוחיות בדיקה, שניתן להניח על גושי האלומיניום בו זמנית (איור 1A).
   4. לאחר שהאגרוז התמצק (10-20 דקות), שפשפו בעדינות כל משטח אגרוז עם ספוג מטבח סטנדרטי או ספוג מלמין כדי להפוך את משטח האגרוז לגס מעט, כך שבעת התזת מים על ג'ל האגרוז תיווצר קרום מים חלק ודק, ולא ייווצרו טיפות מים.
   5. השקיעו את הצלחות במלואן במיכל עם מים מזוקקים עד שהבדיקה מוכנה לביצוע כדי למנוע ייבוש של הצלחות.
2. הכנת מעבר צבע דו-כיווני (אופציונלי)
   1. כדי ליצור סביבה לחה במהלך הבדיקות, הניחו שלושה בלוקים מאלומיניום במרחק של 8 ס"מ זה מזה (איור 1B) על מגבות נייר רטובות.
   2. הפעל את שתי אמבטיות המים ~ 2 שעות לפני תחילת הבדיקה כדי לאפשר מספיק זמן לטמפרטורה של בלוקי אלומיניום לאזן.
      NOTE: מומלץ לבצע ניסוי דמה כדי לקבוע את הטמפרטורה של כל אמבט מים עבור שיפוע דו כיווני. כמה זוגות טמפרטורות אופייניים להגדרת אמבטיות המים מפורטים בטבלה 2. עם זאת, שימו לב שטמפרטורות פני השטח מושפעות מטמפרטורת הסביבה. אורך הצינור משפיע גם על הטמפרטורות מכיוון שיש קירור בצינורות. אורך הצינור במערך שלנו הוא 1.5 מ '.
   3. כדי למנוע מהאגרוז להישפך החוצה מהצלחת, עטפו את שולי לוח האלומיניום בסרט תיוג ליצירת קיר בגובה 10 מ"מ (איור 1B).
   4. באמצעות הגדרת הספק גבוה, מיקרוגל 200 מ"ל של 1% agarose בבקבוק עגול 500 מ"ל רחב פה ויוצקים 120 מ"ל על צלחת בדיקה.
   5. לאחר שהאגרוז התמצק (~ 30 דקות), שפשפו בעדינות כל משטח אגרוז עם ספוג מטבח סטנדרטי או ספוג מלמין כדי להפוך את משטח האגרוז לגס מעט, כך שבעת התזת מים על ג'ל האגרוז, נוצר קרום מים חלק ודק ולא נוצרות טיפות מים.
   6. השקיעו לחלוטין את לוחות הבדיקה במיכל עם מים מזוקקים עד שהבדיקה מוכנה לביצוע כדי למנוע מהם להתייבש.
3. הגדרת מעבר צבע חד-כיווני
   1. הכינו ריאגנטים ופריטים על ספסל ליד מכשיר בדיקת השיפוע (ראו טבלת חומרים).
   2. כדי לקדם העברת טמפרטורה יעילה, מלא את כל הרווחים בין בלוקי האלומיניום לבין לוחות הבדיקה על ידי התזת מים בממשק שבין הבלוקים לצלחת.
   3. בעזרת כפפות, הסירו את צלחות הבדיקה ממיכל המים. אם מים פולשים בין ג'ל האגרוז לצלחת וגורמים להיווצרות בליטות על פני השטח, הסירו את המים עם מיקרופיפטה P1000.
   4. הניחו את לוחות הבדיקה על בלוקי האלומיניום כך שהתיחום של 2 ס"מ משני הקצוות תואם בדיוק לקצוות של בלוקי האלומיניום (איור 1A,C).
   5. רססו מים על פני הצלחת (מספיק קרום מים דק המכסה את משטח האגרוז) כדי למנוע מג'ל האגרוז להתייבש. יש לוודא כי קרום המים רציף ונקי מטיפות מים, שכן הזחלים עלולים להילכד בטיפות מים.
   6. כסו את מערכת השיפוע בקופסת קרטון כדי להפחית את אידוי המים ולסייע בייצוב הטמפרטורה של משטח הג'ל. המתן 5-10 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה להתאזן.
   7. בדקו את טמפרטורת פני השטח ב-12 נקודות על הצלחת (איור 1C). בצע שתי מדידות בתוך כל אזור כדי לקבוע אם יש שונות בתוך אזור או לא. ודא שהטמפרטורה בשני המקומות היא בטווח של ± 0.2 מעלות צלזיוס מהטמפרטורה הרצויה.
      NOTE: שונות בתוך אזור מתרחשת בדרך כלל מכיוון שהמרחקים המדויקים של שני הכתמים לקצה גושי האלומיניום אינם זהים. התאימו את מיקום הלוח על בלוקי האלומיניום כדי לוודא שהתיחום של 2 ס"מ מכל קצה תואם בדיוק לקצוות של בלוקי האלומיניום.
   8. אם שיפוע הטמפרטורה הנמדד חורג מהשיפוע הרצוי, הגדילו או הקטינו את הגדרות טמפרטורת אמבט המים ובדקו מחדש את טמפרטורת פני השטח לאחר התייצבות טמפרטורת המים.
   9. מכסים את מערכת השיפוע בקופסת קרטון עד לתחילת הבדיקה.
4. הגדרת מעבר צבע דו-כיווני (אופציונלי)
   1. הכינו ריאגנטים ופריטים על ספסל ליד מכשיר בדיקת השיפוע (ראו טבלת חומרים).
   2. רססו מים על המשטחים של שלושת בלוקי האלומיניום כדי לקדם העברת טמפרטורה יעילה מגושי האלומיניום ללוחות הבדיקה על ידי מילוי רווחים בין המשטחים.
   3. מוציאים בזהירות את לוחות הבדיקה ממיכל המים ומניחים על קוביות האלומיניום. אם מים פולשים בין ג'ל האגרוז לצלחת, מה שעלול לגרום להיווצרות בליטות על פני השטח, הסר את המים עם מיקרופיפטה P1000.
   4. הניחו את לוח הבדיקה על בלוקי האלומיניום כך שקווי האמצע של האזור הראשון והאחרון משני הקצוות יתאימו בדיוק לקצוות של שני גושי האלומיניום הצדדיים (איור 1B,D).
   5. רססו מים על פני הצלחת (מספיק קרום מים דק המכסה את משטח האגרוז) כדי למנוע מג'ל האגרוז להתייבש. יש לוודא כי קרום המים רציף ונקי מטיפות מים, שכן הזחלים יכולים להילכד בטיפות מים.
   6. כסו את מערכת השיפוע בקופסת קרטון כדי להפחית את אידוי המים ולסייע בייצוב הטמפרטורה של משטח הג'ל. המתינו 5-10 דקות כדי לאפשר לטמפרטורה להתאזן.
   7. בדקו את טמפרטורת פני השטח בשתי נקודות לאורך קו האמצע של כל אחד מ-10 האזורים (איור 1D). בצע שתי מדידות בתוך כל אזור כדי לקבוע אם יש שונות בתוך אזור או לא. ודא שהטמפרטורה בשני המקומות היא בטווח של ± 0.2 מעלות צלזיוס מהטמפרטורה הרצויה.
      NOTE: שונות בתוך אזור מתרחשת בדרך כלל מכיוון שהמרחקים המדויקים של שני הכתמים לקצה גושי האלומיניום אינם זהים. התאם את מיקום הלוח על בלוקי האלומיניום כדי לוודא שקווי האמצע של האזור הראשון והאחרון הקרובים ביותר לכל קצה תואמים בדיוק לקצוות של שני בלוקי האלומיניום הצדדיים.
   8. אם שיפוע הטמפרטורה הנמדד חורג מהשיפוע הרצוי, התאימו את הגדרות טמפרטורת אמבט המים ובדקו מחדש את טמפרטורת פני השטח לאחר ייצוב טמפרטורת המים.
   9. מכסים את הבלוקים בקופסת קרטון עד תחילת הבדיקה.

2. בדיקה וחישוב

1. מוציאים את קופסת הקרטון ובודקים את טמפרטורת פני הג'ל מיד לפני העברת הזחלים לצלחת. מזער את הזמן שבו קופסת הקרטון פתוחה כדי למנוע הפרעה לשיווי משקל הטמפרטורה. אם המשטח יבש, רססו כמות קטנה של מים על המשטח.
2. פיזור 150 ± 50 זחלים ליד מרכז כל צלחת (בין אזורים 3 ו -4 מתוך 6 אזורים) עבור שיפוע חד כיווני (אזור שחרור; איור 1C).
   NOTE: עבור השיפוע הדו-כיווני, פזרו 200-400 זחלים לאורך האזור האמצעי של כל מחצית (איור 1D).
3. הניחו מכסה מיקרו-צלחת מעל כל צלחת בדיקה כדי למנוע מהזחלים לזחול החוצה. כסו את המערך בקופסת קרטון כדי למנוע חשיפה לאור, מה שעלול להשפיע על בחירת הזחל על ג'ל האגרוז.
   NOTE: עבור שיפוע דו כיווני, אין צורך לכסות את הצלחת עם מכסה, כי הצלחת גדולה יותר, ואת הטמפרטורה המועדפת של הזחלים הוא באזור האמצעי. כתוצאה מכך, מעט זחלים מצטברים בקצוות ויש להם הזדמנות לזחול החוצה.
4. אפשר לבדיקה להמשיך במשך 10-30 דקות עבור השיפוע החד-כיווני, ובמשך 15-35 דקות עבור השיפוע הדו-כיווני, בהתאם לגיל הזחלים (טבלה 3).
5. הסר את קופסת הקרטון ואת מכסה צלחת המיקרו. צלמו את הלוחות מלמעלה באמצעות מצלמה דיגיטלית. צלם שתי תמונות של כל לוחית בדיקה, כך שהחוקר יוכל לבחור את זו עם ניגודיות ובהירות טובות יותר לניתוח.
6. הסר את כל הזחלים מלוחות הבדיקה ובכל מקום מחוץ לצלחות על ידי שאיפה.
7. נקו היטב את צלחות הבדיקה, את הצינורות ואת מסננת התאים במים מזוקקים. עשו שימוש חוזר בלוחות הבדיקה שהוכנו באותו יום, אלא אם כן פני השטח של האגרוז ניזוקו.
8. חשב את התפלגות אחוז הזחלים בכל אזור.
   1. פתח את התמונה הצילומית של תוצאות הבדיקה באמצעות כל תוכנה המאפשרת הוספת סימונים לתמונה. כדי לציין את אזורי הבדיקה, צייר קווים אנכיים כל 2 ס"מ בהתבסס על התיחום בלוח הבדיקה.
   2. ספרו את מספר הזחלים בכל אזור ותיעדו את המספרים. אין לספור זחלים באזורים המרוחקים 0.5 ס"מ מכל אחד מהקירות. הג'ל סמיך יותר ליד הקירות, וטמפרטורות פני השטח אינן ליניאריות באזורים אלה.
   3. עבור מעבר הצבע החד-כיווני, חשב את התפלגות האחוזים בכל אזור באופן הבא:
      (מספר הזחלים באזור נתון של 2 ס"מ)/ (מספר כולל של זחלים ב-6 אזורים) x 100.
   4. עבור מעבר הצבע הדו-כיווני, חשב את התפלגות האחוזים בכל אזור באופן הבא:
      (מספר הזחלים באזור נתון של 2 ס"מ)/ (מספר כולל של זחלים ב-5 אזורים בכל צד של השיפוע) x 100.

תוצאות

איור 1: הגדרות בדיקת מעבר צבע יחיד ודו-כיווני. (A) מערך שיפוע חד-כיווני עם שני לוחות בדיקת אלומיניום על שני בלוקי אלומיניום. הטמפרטורות של בלוקי האלומיניום נשלטות על ידי זרימת מים משתי אמבטיות מים. (B) סידור שלושת גושי האלומיניום, אמבטיות מים ופלטת אלומיניום (250 x 220 מ"מ) לשיפוע דו-כיווני. הבלוק השמאלי והימני מחוברים לאותה אמבטיית מים והבלוק האמצעי מחובר לאמבט המים השני. צלחת בדיקת האל...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מנגנון בדיקת שיפוע
PolyScience 9106, אמבט במחזור 6 ליטר בקירור/חימום	תומאס סיינטיפיק	9106	מודל זה הופסק. דגמים חלופיים מעודכנים כוללים: 1186R00 ו- 1197U04 עבור 120 וולט, 60 הרץ או 1184L08 ו- 1197U04 עבור 240 וולט, 50 הרץ.
לוח בדיקת אלומיניום (למעבר צבע חד-כיווני)			גודל חיצוני: 14 x 10.1 x 0.9 ס"מ, גודל פנימי: 12.9 x 8.7 x 0.8 ס"מ, אנודייז שחור.
פלטת אלומיניום (למעבר צבע דו-כיווני)			25 x 22 x 0.2 ס"מ, שחור אנודיזציה.
בלוק אלומיניום			גודל חיצוני: 25.5 x 5 x 1.4 ס"מ, פרמטרים של ערוצים פנימיים מוצגים באיור 1D.
מחבר לבלוקים וצינורות אלומיניום	מקמאסטר-קאר	91355K82
צינורות סיליקון סניטריים Tygon	טייגון	57296	קוטר פנימי (ID) בגודל 1/4 אינץ' x קוטר אופטי בגודל 3/8 אינץ' × קיר בגודל 1/16 אינץ'
שם	חברה	מספר קטלוגי	הערות
פריטים וריאגנטים לבדיקה
פסטל	ארה"ב סיינטיפיק	17361	Pestle עבור 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge
המדחום	פלוק	51II
זוג תרמי	פלוק	סוג K
מכסה מיקרו-צלחת אוניברסלי	קורנינג	6980א77
צלחת 35 מ"מ	קורנינג	9380D40
סרט תיוג (למעבר צבע דו-כיווני)	פישר סיינטיפיק	15-951	סרט תיוג Fisherbrand 2 ב x 14 yds
אגרוז	Invitrogen	16500500	הכינו פתרון של 1%
סוכרוז	סיגמא	S0389-5KG	הכן פתרון של 18% ממש לפני תחילת הבדיקה
מברשת צבע	פישר סיינטיפיק	11860
צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל	דנוויל	C1062-P
סקופולה	פישר סיינטיפיק	14-357Q
500 מ"ל בקבוק עגול רחב פה	פירקס	1395-500
מסננת תאים (נקבוביות 300 מ"מ)	פלוריבחר	43-50300	פריט אופציונלי לשטיפת זחלים
קופסת קרטון (מגש בקבוקונים)	ג'נסי סיינטיפיק	FS32-124