דרוזופילה מוניטור פעילות (DAM): שיטה למדידת פעילות מוטורית בזבובים

תקציר

מקור: Chiu, J. C., et al. Assaying פעילות לוקומוטורית לחקר מקצבים צירקדיים ופרמטרי שינה בדרוזופילה. J. Vis. Exp. (2010).

סרטון וידאו זה מתאר את מערכת ניטור פעילות דרוזופילה (DAM) המשמשת למעקב אחר פעילות לוקומוטורית. חוקרים משתמשים בנתוני פעילות שנאספו מה-DAM כדי לחקור את השעון הביולוגי בזבובי פירות. סרטון הפרוטוקול המוצג מראה כיצד לטעון זבובים במכשיר ולתעד נתוני פעילות עבור ניסויים צירקדיים.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Chiu et al., Assay Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp.(2010).

1. העמסת זבובים לתוך צינורות פעילות ומערכת ניטור פעילות לוקומוטורית

1. לפני העמסת זבובים לתוך צינורות פעילות, הפעל את האינקובטורים שישמשו לאחסון צגי הפעילות. כוונן את הטמפרטורה באמצעות פקדי האינקובטור והגדר את משטר האור/חושך באמצעות בקר האור של מערכת DAM או מערכת בקרת האור של האינקובטורים עצמם בהתאם לתכנון הניסוי הרצוי. הזמן הדרוש להעמסת זבובים לתוך צינורות פעילות צריך להיות מספיק כדי שהטמפרטורה תתייצב.
2. מרדימים את הזבובים בפחמן דו חמצני.
3. השתמשו במברשת צבע עדינה כדי להעביר בעדינות זבוב בודד לתוך צינור פעילות.
4. תפסו את האמצע של פיסת חוט בודדת שאורכה כחצי אינץ' בעזרת מלקחיים עדינים והכניסו את החוט לקצה הלא מזון של צינור הפעילות כדי לסתום את הפתח ולמנוע מהזבוב לברוח במהלך הניסוי, ובמקביל לאפשר זרימת אוויר לתוך הצינור. לחלופין, ניתן להשתמש במכסי פלסטיק עם חורים קטנים (Trikinetics, Inc.) כדי לסגור את הפתח.
5. ודאו שהצינורות מונחים על צידיהם עד שהזבוב מתעורר, אחרת קיימת סכנה שהזבוב יידבק למזון.
6. הכנס את הצינורות לצגי הפעילות. עם המודל החדש והקומפקטי יותר של צגי טריקינטיקה (Trikinetics DAM2 ו- DAM2-7), יש צורך להחזיק את הצינורות במקום עם גומיות כדי להבטיח שקרן האינפרא אדום תעביר את הצינור במיקום המרכזי.
7. הכניסו את מוניטרי הפעילות לחממות וחברו אותם למערכת איסוף הנתונים באמצעות חוטי הטלפון. בדוק באמצעות תוכנת האיסוף של מערכת DAM כדי לוודא שכל הצגים מחוברים כראוי והנתונים נאספים מכל אחד מהם. הצג פולט קרן אור אינפרא אדום על פני מרכז כל צינור פעילות זכוכית. הפעילות המוטורית של הזבובים נרשמת כנתונים בינאריים גולמיים כאשר "אחד" נרשם בכל פעם שקרן האינפרא אדום נשברת או נרשם "אפס" שבו קרן האינפרא אדום אינה נשברת.

2. תכנון ניסויי לרישום נתונים לקביעת מחזוריות ומשרעת צירקדית

1. הזבובים מסונכרנים ומאומנים על ידי חשיפתם למשטר האור/חושך הרצוי (LD) וטמפרטורה למשך 2-5 ימים מלאים. תנאי האילוף הנפוץ ביותר הוא מחזור בהיר/כהה של 12 שעות אור / 12 שעות חושך (12:12 LD) ב 25 ° C. תנאי סטנדרטי מקובל זה מבוסס בעיקרו על המחשבה שמקורו של דרוזופילה במקומות אפרו-משווניים. כאשר לומדים מקצבים צירקדיים יש כמה ביטויים שצריך להכיר. רלוונטי לפרוטוקול זה, הזמן שבו האורות נדלקים באינקובטור מוגדר כזמן צייטגבר 0 (ZT0) וכל שאר הזמנים הם יחסיים לערך זה (למשל, במחזור LD של 12:12, ZT12 הוא הזמן שבו האורות כבויים). בתנאי LD סטנדרטיים של 12:12, Drosophila melanogaster מסוג פראי מציג בדרך כלל שני התקפי פעילות; אחד סביב ZT0 המכונה שיא "בוקר" ואחר סביב ZT12 המכונה שיא "ערב" (איור 1A). התקפי הבוקר והערב נשלטים על ידי השעון האנדוגני, אך ישנן גם תגובות "בהלה" שהן פרצי פעילות חולפים בתגובה למעברי האור והחושך. יומיים של אימון הם המינימום וניתן להשתמש בהם, למשל, במסכים גדולים שגוזלים זמן רב יותר ומיועדים למדידת תקופות ריצה חופשית בחשיכה מתמדת (ראו להלן, שלב 2). עם זאת, אם אתם מעוניינים ללמוד את דפוסי הפעילות במהלך מחזור יומי, עדיף לשמור על הזבובים במשך 4-5 ימים ב- LD כדי לקבל נתונים נוספים. בעיקרו של דבר, הגדלת מספר הזבובים או מספר ימי LD בניתוח הנתונים הסופי (למשל, נתוני מאגר מהיומיים האחרונים של פעילות מנוע LD) תפיק פרופילי פעילות יומיים אמינים יותר ומדידות (למשל, תזמון שיא הבוקר או הערב). יתר על כן, התפלגות הפעילות היומית משתנה כפונקציה של אורך היום (פוטופריוד) וטמפרטורה. סיבה עיקרית לשינוי הפוטופריוד או הטמפרטורה מהתקן היא אם רוצים לחקור כיצד דפוסי הפעילות היומיומית עוברים הסתגלות עונתית (לדוגמה, Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). דרוזופילה יכולה גם להיות מאומנת למחזורי טמפרטורה יומיים (למשל Glaser and Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). מחזורי טמפרטורה המשתנים רק ב 2-3 ° C מספיקים כדי לאמן את מקצבי הפעילות.
2. מקצבי הפעילות המוטורית של ריצה חופשית נמדדים בתנאי חושך וטמפרטורה קבועים לאחר סיום תקופת האימון (ראה לעיל, שלב 1). ניתן לשנות את ההגדרה של מחזור האור בכל עת בשלב החשוך ביום האחרון של LD כך שהיום הבא של הניסוי מייצג את היום הראשון של DD. שבעה ימים של איסוף נתוני DD מספיקים כדי לחשב את התקופה הצירקדית ואת המשרעת (למשל, כוח או עוצמת הקצב) של זבובים. באופן כללי, גודל מדגם של לפחות 16 זבובים נחוץ כדי לקבל תקופות ריצה חופשיות אמינות עבור גנוטיפ מסוים. גם אם מעוניינים רק למדוד את הפעילות היומית, עדיין עדיף למדוד את תקופות הריצה החופשית של הזבובים ב-DD מכיוון ששינויים בתקופה האנדוגנית יכולים לשנות את התפלגות הפעילות היומית ב-LD. לדוגמה, זבובים עם תקופות אנדוגניות ארוכות בדרך כלל מציגים שיאי ערב מאוחרים ב-LD (למשל, ראו איור 2).
3. בסיום הניסוי, נתונים בינאריים גולמיים שנאספו באמצעות תוכנת מערכת DAM יורדים להתקן אחסון נתונים נייד, למשל מפתח USB.
4. הנתונים הבינאריים הגולמיים מעובדים באמצעות DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) ומסוכמים לסלים של 15 ו -30 דקות בעת ניתוח פרמטרים צירקדיים, או פחים של 1 עד 5 דקות בעת ניתוח פרמטרים של שינה/מנוחה. כיום, חמש דקות רצופות של חוסר פעילות הן ההגדרה הסטנדרטית של שינה/מנוחה בדרוזופילה (Hendricks et al., Neuron (2000); הו וסגל, שיטות אנזימול., (2005)).
5. ישנן דרכים רבות ושונות לנתח את הנתונים הנאספים במערכת DAM, אך אנו נספק רק שיטות אלה המשמשות באופן שגרתי במעבדה שלנו. Microsoft Excel משמש להקצאת גנוטיפ לקבוצות מדגם שונות. תוכנת FaasX (M. Boudinot and F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, צרפת) או Insomniac (תוכנה מבוססת Matlab; לסלי אשמור, אוניברסיטת פיטסבורג, פנסילבניה) משמשים לבחינת פרמטרים צירקדיים (למשל מחזור ועוצמה) או שינה/מנוחה (למשל אחוזי שינה, אורך התקף מנוחה ממוצע) בהתאמה.

תוצאות

איור 1: גרפים של אינדוקציה שנוצרו באמצעות FaasX ומראים מקצבי פעילות מוטורית יומית של זבובי בר קצביים (w לכל⁰ זבובים הנושאים טרנסגן per+) (A ו-B) לעומת w אריתמי לכל⁰ מוטנטים (C ו-D). זבובים זכרים הוחזקו בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ואומנו במשך 4 ימים במחזורי 12:12 LD (אור: חושך) ולאחר מכן שבעה ימים ב-DD (חושך מתמיד). עבור כל קו זבובים, רמות הפעילות המוטורית של זבובים בודדים (n>32...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מוניטור פעילות דרוזופילה (DAM)	טריקינטיקה בע"מ; וולת'הם, מסצ'וסטס	DAM2 או DAM5	צגי DAM2 קומפקטיים יותר, ורבים יותר יכולים להיכנס לחממה אחת
יחידת ממשק ספק כוח (עבור מערכת DAM)	טריקינטיקה בע"מ; וולת'הם, מסצ'וסטס	PSIU9	כולל ספק כוח AC PS9-1
בקר תאורה	טריקינטיקה בע"מ; וולת'הם, מסצ'וסטס	LC6
צינורות זכוכית Pyrex	טריקינטיקה בע"מ; וולת'הם, מסצ'וסטס	PGT5, PGT7 ו-PGT10
מכסי צינור פעילות פלסטיק	טריקינטיקה בע"מ; וולת'הם, מסצ'וסטס	קאפ5	ניתן להשתמש בחוטים במקום מכסי פלסטיק.
תוכנת איסוף נתונים של מערכת DAM	טריקינטיקה בע"מ; וולת'הם, מסצ'וסטס		גרסאות זמינות הן עבור Mac והן עבור PC
תוכנת FaasX	Centre National de la Recherche Scientifique		רק עבור Mac
תוכנה Insomniac 2.0	בית הספר לרפואה של אוניברסיטת פיטסבורג		פועל על Matlab. ניתן לשימוש הן במחשב והן במקינטוש.
אינקובטור סביבתי עם בקרת טמפרטורה ויום, למשל אינקובטור פרסיבל	Percival Scientific, Inc.	I-30BLL	ממד חלל פנים:רוחב: 65 ס"מ; גובה: 86 ס"מ; עומק: 55 ס"מ
אינקובטור סביבתי עם בקרת טמפרטורה ויומיות, למשל אינקובטור חימום/קירור DigiTherm עם תאורה צירקדית מתוזמנת וטמפרטורה מתוזמנת	Tritech Research, Inc.	05DT2CIRC001	ממד חלל פנים:רוחב: 36 מ '; גובה: 56 מ '; עומק: 28 ס"מ
APC Smart-UPS 2200VA 120V (יחידת גיבוי חשמל לשעת חירום)	נגמ"ש	SU2200NET	הספק יציאה של 1600 וואט
סוכרוז	סיגמא-אולדריץ'	S7903
בקטו אגר	BD Biosciences	214010
TissuePrep כדורי פרפין	פישר סיינטיפיק	T565	נקודת התכה 56°C-57°C
תנור חימום בלוקים	VWR הבינלאומי	12621-014