$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
פרוטוקול זה הוא קטע מתוך De Vries and Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. צור זבובי Channelrhodopsin
- קרוס UAS-ChR2 טס עם הנהג Gal4 על פי בחירתך, אנו משתמשים G105-Gal4, אשר מבוטא נוירונים Foma-1 באונה הראייה.
- כדי למנוע את האפשרות של תגובה חזותית לגירוי האור הכחול, שני קווי הזבוב נמצאים ברקע w+norpA.
- התוצאה הסופית: w+norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- לאחר שזבובים בוגרים מתקרבים, יש לשים נקבות נבחרות על מזון טרי, בתוספת 10 מיקרומטר all-trans-retinal (קו-פקטור נדרש עבור ChR2) ומוגן מפני אור, במשך 3 ימים לפני ביצוע הבדיקה ההתנהגותית.
2. הכינו 10 מיקרומטר מזון משופר All-trans-trans-retinal
- להמיס 100 מ"ג של all-trans-retinal ב 17.6 מ"ל של 95% אתנול כדי להפוך 20 mM רשתית. יש להגן על כל ה-trans-retinal מפני אור בכל עת.
- המיסו מזון רגיל מקמח תירס במיקרוגל, ותנו לו להתקרר עד שהוא חם למגע.
- מערבבים 50 μl של 20 mM all-trans-retinal לתוך בקבוקונים של 10 מ"ל של מזון זבובים.
- תנו לבקבוקונים להתקרר ושמרו על עצמם מוגנים מפני אור.
3. ציוד
- קצוות פיפט: קצוות פיפט סטנדרטיים של 1,000 μl נחתכים בסמוך לקצה, ויוצרים קוטר נקבוביות של ~2.25 מ"מ.
- פלטפורמה (ראו איור 1).
- בסיס דלרין, 17 ס"מ X 25 ס"מ, נבנה עם חורים מושחלים בכל פינה כדי להתאים למחברי צינור קירור NPT בגודל 1/4 אינץ'.
- מחזיק אנכי, עשוי דלרין, מחובר למרכז הבסיס. המידות הכוללות הן 25 מ"מ X 40 מ"מ X 65 מ"מ (רוחב X עומק X גובה). חריץ ברוחב 10 מ"מ עובר לאורך המחזיק, עם בורג אגודל בתחתית. לחלק העליון של המחזיק מחוברת פלטפורמה, 25 מ"מ X 40 מ"מ X 10 מ"מ, עם חור בקוטר 3.5 מ"מ מיושר עם החריץ במחזיק.
- מערכי LED (ראו איור 1).
- ארבע זרועות של צינור נוזל קירור, באורך ~ 18 ס"מ, מוצמדות לבסיס הפלטפורמה באמצעות מחבר צינור נוזל הקירור. צינור נוזל קירור משמש רק כתמיכה מבנית ואינו משמש למטרות קירור.
- חריצים מרווחים כראוי נחתכים לתוך החתיכה האחרונה של צינור נוזל קירור של כל זרוע כדי להצמיד גוף קירור לקצה של כל זרוע.
- LED Rebel Tri-Stars כחול מותקן על כל גוף קירור באמצעות סרט הדבקה תרמי חתוך מראש. עדשת Carclo 18° Tri-lens מודבקת לכל Tri-Star.
- LED Tri-Stars מחווטים למנהלי ההתקן של BuckPuck DC ולספק כוח כפי שצוין. סידרנו את המערך שלנו כשכל באק-פאק מפעיל שני טרי-סטארים בסדרה.
- הארה של כל ארבעת כוכבי ה-LED ב-700 mA הניבה קרינה של 713 W/m2 על הפלטפורמה שלנו.
- מצלמה: המצלמה מורכבת על חצובה קטנה וממוקדת בחלק העליון של הרציף.
4. בדיקה התנהגותית
- מרדימים בקצרה זבובים על קרח.
- הניחו זבובים בודדים בקצות הצינורות, והשתמשו בנייר דבק כדי לסגור את שני קצוות הקצה.
- לאחר שהזבובים התעוררו והם חוקרים באופן פעיל את קצה הפיפט, הסירו את הסרט והניחו צינור בחריץ במחזיק אנכי. בורג האגודל משמש כדי לאבטח את קצה הצינור במקומו ולסגור את החלק התחתון של הקצה.
- כאשר הזבוב חוקר את קצה הצינור (בדרך כלל 30 - 60 שניות), התחל את הקלטת המצלמה ממש לפני שהזבוב מגיח מהקצה אל הרציף.
- לאחר שהזבוב הגיח אל הרציף, המתן 1-2 שניות, והפעל את נוריות ה- LED הכחולות. השתמש בטיימר כדי למדוד ידנית את הזמן עד שהטיסה מתחילה לטוס.
