הכנת לב דרוזופילה: טכניקה לחקר פיזיולוגיה של הלב בזבוב הבוגר

תקציר

מקור: Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the Beating Heart in Drosophila. J. Vis. Exp. (2009).

סרטון זה מתאר את ליבו הבוגר של הזבוב, או נקרא אחרת הכלי הגבי דרוזופילה. הפרוטוקול המוצג מדגים הליך דיסקציה לתכשירי לב חי.

פרוטוקול

פרוטוקול זה הוא קטע מתוך Vogler and Ocorr, Visualizing the Beating Heart in Drosophila, J. Vis. Exp. (2009).

1. לפני שתתחיל

1. תמיסת המולימפה מלאכותית (AH) טרייה המכילה 108mM Na⁺, 5mM K+, 2mM Ca²⁺, 8mM MgCl₂, 1mM NaH₂PO₄, 4mM NaHCO₃, 10mM סוכרוז, 5mM טרהלוז, 5mM HEPES (pH 7.1, כל הריאגנטים מבית Sigma Chemicals). יש להוסיף את הסוכרוז והטרהלוז ל-AH מתמיסות מלאי בקירור ממש לפני השימוש על מנת למנוע זיהום חיידקי.
2. הביאו את AH לטמפרטורת החדר וחמצן את התמיסה על ידי בעבוע אוויר למשך 15 דקות לפחות.
3. משוך מספר נימים עדינים (למשל נימי זכוכית, 100ul, VWR) הדרושים להסרת שומן.

2. לב דרוזופילה שלם למחצה מהזבוב הבוגר

1. זבובי דרוזופילה בוגרים מורדמים באמצעות Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) למשך 2-5 דקות. יש להקפיד לא להשאיר את הזבובים בתנומת הזבוב לחשיפות ארוכות יותר. חשיפה לטווח קצר לקור יכולה לשמש גם להרדמת זבובים, אך CO₂ אינו מומלץ מכיוון שיש לו השפעות ארוכות טווח על קצב הלב והקצב.
2. זבובים מורדמים מוכנסים, בצד הגבי כלפי מטה, לתוך צלחת פטרי המצופה בשכבה דקה של ג'לי נפט. הקוטיקולה ההידרופובית בכנפיים ובגוף "נדבקת" באופן הפיך לג'לי, אך ניתן למקם את הזבוב מחדש במידת הצורך. זה הופך להיות חשוב במיוחד במהלך מניפולציות הבאות.
3. חיתוך ראשוני נעשה באמצעות זוג מספריים קפיציים מעוקלים (Roboz #5611). להבי המספריים ממוקמים מתחת לרגליים ומופנים כלפי מטה לכיוון המשטח הגבי של בית החזה ליד הצוואר. הראש, חוט העצב הגחוני והרגליים מוסרים בחתך יחיד. לאחר מכן התכשיר שקוע בתמיסת המולימפה מלאכותית מחומצנת (AH).
4. בעזרת מספריים קפיציים מסירים את הקצה האחורי של הבטן (המורכב ממקטעי בטן 7 ו-8) בחתך יחיד. זה מספק גישה לביצוע חתכים רוחביים לאורך שני קצוות הבטן ומשמש לנתק את הקשר בין המעי האחורי לקוטיקולה הבטן. לאחר מכן מסירים את הדש המשוחרר של הקוטיקולה הגחונית של הבטן.
5. בשלבים 3 ו-4 הקשרים הקדמיים והאחוריים של המעי מנותקים, כך שאיברי הבטן מוחזקים כעת במקומם רק על ידי קנה הנשימה. בדרך כלל ניתן להסיר את המעי ואיברי בטן אחרים כמסה אחת באמצעות מלקחיים של תכשיטן (Roboz, #55) ומשיכה עדינה. הסרת האיברים הפנימיים חושפת את צינור הלב הפועם שעדיין מחובר לקוטיקולה הגבית מוקפת בגופי שומן.
6. גופי השומן אטומים למדי במיקרוסקופ האור ולכן לעתים קרובות יש צורך להסיר חלק מהשומן הזה על מנת לראות את צינור הלב בבירור. זה מושג על ידי טכניקת שאיבת שומן באמצעות נימי זכוכית מצוירים דק. נימים מיוצרים באמצעות מושך פיפטה סטנדרטי (למשל Sutter P-97 Pipette Puller) ולאחר מכן מוכנסים לתוך צינורות פלסטיק (Tygon, "1/16) המחוברים למקור ואקום. מערכת זו משמשת לשאיבת עודפי שומן מסביב לצינור הלב. כוח היניקה פרופורציונלי לקוטר החוד ולכן אין להשתמש בפיפטות בקוטר של יותר מ-40 מיקרון. יש לנקוט משנה זהירות כדי להימנע מלגעת בלב עצמו ומכיוון שהחלק האחורי של הלב שביר מאוד, יש להימנע לחלוטין מאזור זה.
7. צינור הלב הבוגר דרוזופילה חשוף כעת ואמור לפעום. במידת הצורך, ניתן למקם מחדש את הקוטיקולה ואת הלב המחובר על ידי הרמה עדינה של הקוטיקולה מתוך ג'ל הפטרולאום ובזהירות לאלף אותו בחזרה למטה, שוב הימנעות מכל מגע עם רקמת הלב. בשלב זה יש להחליף את הפתרון השוטף את התכשיר ב- AHL טרי. הכנה זו צריכה להיות מותרת שיווי משקל במשך 20-30 דקות עם חמצון לפני כל מניפולציות. אם ההכנה היא להישמר במשך יותר מ 60 דקות זה צריך להיות מחורר עם AHL טרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרו חותך מספריים קפיץ (מעוקל)	רובוז כלי ניתוח ושות'	RS-5611	טוב לקיצוצים ברוטו (שלב 2)
מספריים קפיציים לניתוח מיקרו (ישר)	רובוז כלי ניתוח ושות'	RS-5620
Dumont #55 מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11295-51
Dumont #5 מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11295-10
נימי זכוכית, דקים	מוצרים מדעיים	GB100T8P
פיפטה פולר	ציוד סאטר	P-97	גם מושכים פיפטה אופקיים וגם אנכיים יעבדו
צינורות פלסטיק	טייגון	קוטר פנימי של 1/16 אינץ'	עבור נימים של 100 μl
דבק רקמת היסטואקריל®	ב. בראון מדיקל