$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Cornwell et al, The Replica Set Method: A High-throughput Approach to Quantitatively Measure Caenorhabditis elegans Lifespan, J. Vis. Exp. (2018).
1. מניעת ייצור צאצאים על ידי תוספת של 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR)
- לגדל בעלי חיים עד שלב L4 ב 20 ° C. בדוק אם בעלי חיים מסונכרנים התפתחו L4 כ 40 שעות לאחר הזריעה (שלב 2.1.7).
הערה: זמן ההתפתחות של C. elegans ישתנה בטמפרטורות שונות ויש לבדוק אמפירית את קצב הגדילה של בעלי חיים מוטנטיים ששיעורם לא התאפיין.
- הוסף 160 μL של 50x FUdR לכל צלחת 6 ס"מ עם L4 animals.
NOTE: זה קריטי להוסיף FUdR בשלב L4. לנוחותכם, הכינו מלאי של 1,000x של FUdR על ידי המסת 1 גרם FUdR לתוך 10 מ"ל אולטרה-טהור H2O. סנן-חיטוי מלאי FUdR עם מסנן 0.2 מיקרומטר ומזרק 10 סמ"ק. Aliquot ~ 1 מ"ל מלאי לתוך צינורות סטריליים 1.5 מ"ל. יש להקפיא ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
- בדוק צלחות לנוכחות של זכר C. elegans. הסר את כל הזכרים.
NOTE: תוחלת החיים נמדדת בדרך כלל עבור הרמפרודיטים ולא עבור זכרים. הרמפרודיטים שמזדווגים חיים זמן קצר יותר מבעלי חיים לא מזווגים, אפילו בנוכחות FUdR. הזכרים קטנים ודקים יותר מהרמפרודיטים וניתן לזהותם בקלות על ידי זנב מכור ייחודי.
- החזירו את הקופסה לשקית נעילת הרוכסן. חזור לאינקובטור של 20 מעלות צלזיוס.
2. כדאיות הניקוד
- הבקיע את יכולת הקיום מדי יום על ידי נגיעה עדינה בחיה בראשה עם חוט פלטינה או ריסים. ציון חיות שלא זזות כמתות והוציאו אותן מהצלחת (איור 1A). רשום את מספר המתים שנצפו עבור כל מצב עבור כל נקודת זמן תצפית.
NOTE: כדי להפחית את הסיכון להטיית ניקוד, על הנסיין להישאר עיוור לתנאי הניסוי ובאופן דומה אסור לו להתייחס לתוצאות מנקודות זמן קודמות במהלך הניקוד.
- צנזרו בעלי חיים שנקרעים, מתים מפגמי התפתחות ברורים אחרים, או זוחלים למעלה בצד המנה: הוציאו את בעלי החיים האלה ורשמו את המספר בכל נקודת זמן שנצפתה לצורך התחשבות בניתוח הסטטיסטי. בנוסף, אם נמצאו זכרים, הסר אותם ורשום את המספר שנצפה.
- חזור על הפעולה משלב 2.1 מדי יום עד שלא יישארו בעלי חיים בחיים.
NOTE: אם הדשא של E. coli מצטמצם באופן משמעותי או פטרייה מתחילה לצמוח על הצלחת, להעביר את כל החיות הנותרות לצלחת טרייה עם RNAi ו FUdR המתאימים.
