עיכול אנזימטי ודיסוציאציה ידנית: שיטה להכנת עוברים מסוג C. elegans לתרבית תאים

תקציר

מקור: Sangaletti, R. and Bianchi, L. שיטה לגידול תאי C. elegans עובריים.J. Vis. Exp.(2013).

סרטון זה מציג שיטה לבידוד ותרבית סטרילית של תאי C. elegans עובריים במבחנה.

פרוטוקול

1. דיסוציאציה של תאים עובריים

1. בצע את השלבים הבאים של ההליך בתנאים סטריליים באמצעות מכסה מנוע זרימה למינרית. בעוד בעלי חיים לבושים על צלחות חיידקים, השטיפות והטיפול בתמיסת הליזיס המכילה אקונומיקה אמורים לחסל את רוב אם לא את כל החיידקים. לפיכך, שימוש במכסה מנוע למינרי בשלב זה של ההליך מונע זיהום חדש של תרחיף הביצה.
2. מרחפים ביצים בכדוריות ב-1 מ"ל של כיטינאז במינון 2 מ"ג/מ"ל (מלאי ב-pH 6.5) ומעבירים אותן לצינור חרוטי סטרילי חדש בנפח 15 מ"ל. רוק את הצינור במשך 10-30 דקות בטמפרטורת החדר. זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לרעננות האנזים ולטמפרטורת החדר ולכן יש לקבוע אותו לכל תכשיר. מומלץ להתחיל לעקוב אחר הביציות תחת מיקרוסקופ תרבית תאים הפוכה לאחר 10 דקות של דגירה. הערה: מניסיוננו, pH נמוך מגביר את הפעילות האנזימטית של כיטינאז. מסיבה זו אנו משתמשים במאגר ביצים ב- pH 6.5 כדי להמיס chitinase (מתכון שדווח לעיל, שבו pH מותאם ל 6.5 באמצעות NaOH).
3. כאשר ~ 80% מקליפות הביצים מתעכלות על-ידי טיפול בכיטינאז (איורים 1 A-B), מטילים את הביצים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 900 x גרם (~2,500 סל"ד) למשך 3 דקות. בעזרת פיפטור P1000 וקצוות סטריליים, מסירים בזהירות את הסופרנאטנט ומוסיפים 3 מ"ל של מדיום L-15.
4. מעבירים את הביצים לצלחת בקוטר 6 ס"מ ומנתקים בעדינות את התאים באמצעות מזרק סטרילי 10 מ"ל המצויד במחט 18 גרם. עקוב אחר מידת הדיסוציאציה על ידי הנחת טיפת תרחיף לתוך צלחת פטרי פלסטיק טרי ועל ידי צפייה מתחת למיקרוסקופ. אין לשאוף אוויר לתוך המזרק במהלך הליך זה כדי למנוע פגיעה בתאים. המשך את הדיסוציאציה עד ~ 80% מהתאים מנותקים.
5. סננו את המתלה באמצעות מסנן מיליפור סטרילי בגודל 5 מיקרומטר. יש לסנן את מתלי התאים על מנת להסיר גושי תאים, ביצים לא מעוכלות וזחלים שבקעו. סננו 4-5 מ"ל נוספים של מדיה L-15 טרייה דרך המסנן כדי לשחזר את כל התאים. אין להשתמש בכוח מופרז במהלך שלב הסינון כדי למנוע נזק למסנן ו/או לתאים.

2. תאים מטפחים

1. משחררים את התאים המנותקים על ידי צנטריפוגה ב 900 x גרם (~ 2,500 סל"ד) למשך 3 דקות. באמצעות פיפטור P1000 וקצוות סטריליים בזהירות להסיר את כל supernatant. מרחפים מחדש את התאים הכדוריים במדיום L-15 שלם וצלחת 1 מ"ל/באר. כמות המדיום שנוסף תלויה במספר 8P הצלחות בהן נעשה שימוש, מפגש התולעים על הצלחות, וסוג הניסויים שיבוצעו על התאים. צפיפות התא יכולה להיקבע באמצעות המוציטומטר. עבור הקלטות מהדק טלאי, צפיפות ציפוי של ~ 230,000 תאים / ס"מ² היא אופטימלית.
2. שמרו את צלחת 24 הבארות במיכל טאפרוור מפלסטיק המכיל מגבות נייר רטובות כדי למנוע אידוי של מדיום התרבית. אחסנו את המיכל באינקובטור לח בטמפרטורה של 20°C ואוויר הסביבה.
3. התאים בדרך כלל מוכנים לניסויים תוך 24 שעות כאשר ההתמיינות המורפולוגית והביטוי של סמני GFP הושלמו. תאים יכולים להישמר בתרבית עד 2 שבועות, אבל הם בדרך כלל בריאים ביותר עד 7-9 ימים לאחר ציפוי. המדיום צריך להיות מוחלף פעם ביום כדי לשמור על תאים בריאים.

תוצאות

איור 1. C. elegans עוברים לפני ואחרי טיפול בכיטינאז. (A) צילום ביצים לפני חשיפה לכיטינאז. החץ מצביע על קליפת הביצה השקופה והשלמה המקיפה עובר. (B) ביצים שטופלו בכיטינאז במשך 10 דקות. קליפות הביצים התעכלו ואינן נראות עוד סביב העוברים. החיצים מצביעים על עוברים משולשים ששוחררו מקליפת הביצה. התיבה הכחולה מקיפה קבוצת תאים שעדיין מחוברים זה לזה.

חומרים

<גבול טבלה="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:739px;" width="738"> רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה שם חברה מספר קטלוג הערות REAGENTS Leibovitz's L-15 Medium (1x) נוזל Invitrogen 11415-064 סרום בקר עוברי Invitrogen 16140-063 פניצילין-סטרפטומיצין סיגמא P4333-100ML Chitinase from Streptomyces Griseus סיגמא C6137-25UN Peanut Lectin סיגמא L0881-10MG EQUIPMENT 101-1000 μl כחול מדורג טיפים לפיפט ארה"ב Scentific 1111-2821 10 מ"ל Pipet מעוקר עטוף בנפרד ארה"ב Scentific 1071-0810 נפח משתנה ארגונומי (100-1000 μl) פיפטור עם מפלט קצה VWR אינטרנשיונל בע"מ 89079-974 Portable Pipet Aid, דראמונד VWR אינטרנשיונל בע"מ 53498-103 Transfer פלסטיק Pipet סטרילי VWR אינטרנשיונל בע"מ 14670-114 15 ml צינור חרוטי ארה"ב Scentific 1475-1611 מד סטרילי 18 מחטים בקטון, דיקינסון ושות' 305196 סטרילי 10 מ"ל מזרקים בקטון, דיקינסון ושות' 305482 מסנני מזרק פלסטיק קורנינג גודל נקבוביות 0,20 מיקרומטר קורנינג 431224 Acrodic 25 mm מסנן מזרק עם 5 מיקרומטר ורספור ממברנה VWR אינטרנשיונל בע"מ 28144-095 60x15 מ"מ צלחת פטרי סטרילית VWR אינטרנשיונל בע"מ 82050-548 100x15 מ"מ צלחת פטרי סטרילית VWR אינטרנשיונל בע"מ 82050-912 12 מ"מ קוטר זכוכית כיסויים VWR אינטרנשיונל בע"מ 48300-560 צלחות תרבית תאים שקופות 24 תחתונים שטוחים היטב עם מכסה תומאס סיינטיפיק 6902A09 Dumont #5- מלקחיים עדינים כלים מדעיים משובחים 11254-20 צנטריפוגה 5702 אפנדורף 22629883 Laminar Flow Hood מיקרוסקופ הפוך עם מטרה x10 אינקובטור לח אוויר