ג. אלגנס מעקב אחר תנועה: שיטה להערכת תנועה בתולעים

תקציר

מקור: Davies, A. G. et al. An Assay for Measurement the effects of Ethanol on the locomotion speed of Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp.(2015).

סרטון זה מתאר את השימוש בתוכנת וידאו ומעקב כדי להקליט תנועת תולעים בזירה. הפרוטוקול לדוגמה מודד את ההשפעה של חשיפה לאתנול על תנועת תולעים.

פרוטוקול

הפרוטוקול הבא הוא קטע מתוך Davies et al, An Assay for Measurement the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2015).

1. שלבים לביצוע ביום שלפני הבדיקה

   1. בחרו תולעי שלב L4 לצלחות גידול נמטודות טריות (NGM) שנזרעו עם מדשאה של OP50 E. coli, ותרבו אותן בטמפרטורה של 20°C O/N. כל תנאי בדיקה דורש 10 תולעים; בחר עודף של תולעים כדי לאפשר אובדן O/N של תולעים.
      1. בדקו רק בעלי חיים שהם בוגרים של היום הראשון; מוטנטים רבים גדלים במהירות איטית יותר מאשר סוג הבר. התאימו את תזמון הקטיף לזנים בעלי עיכוב התפתחותי, כך שכל בעלי החיים שנבדקו יהיו בוגרים ביום הראשון.
2. שלבים לביצוע ביום הבדיקה
   1. הכנה לבדיקה:
      1. בצע בדיקות על לוחות NGM סטנדרטיים בגודל 60 x 15 מ"מ ללא זרעים. יבשו את כל הצלחות לשימוש בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים, עם מכסים כבויים. עבור כל ניסוי, השתמש בארבע צלחות NGM מיובשות; אלה יהיו צלחות בדיקת אתנול 0 mM ו- 400 mM ולוחות ההתאקלמות הנלווים אליהם.
         NOTE: השימוש בצלחות NGM חשוב כאן; הבדלים בהרכב הצלחות, במיוחד האוסמולריות שלהם, יכולים להשפיע מאוד על תגובת המינון של אתנול על התנהגות, זה נובע, לפחות בחלקו, משינויים בכמות האתנול שנצברה על ידי בעלי החיים. אגר NGM הוא 160 mOsm.
      2. לאחר הייבוש, יש לשקול כל אחת מלוחות ה-NGM ללא זרעים שישמשו בבדיקה ולציין את המשקל. קבע את נפח המדיה בלוחות בהתבסס על משקל צלחת ריקה. כדי להעריך בקירוב את המרת משקל האגר לנפח, נניח שמשקל המדיה זהה לנפח שווה של מים.
         NOTE: התוצאות העקביות ביותר שלנו נמצאו עם חומרי גז טבעי נוזלי שהתייבשו במידה מספקת כך שלנפח מקורי של 10 מ"ל יש נפח לאחר ייבוש בין 8.3-8.9 מ"ל. חלופה לזמן הייבוש של שעתיים היא להתייבש עד שהלוחות יגיעו לטווח נפחים זה כדי להסביר את ההבדלים באינקובטורים.
      3. המיסו 4 טבעות נחושת (קוטר פנימי של 1.6 ס"מ) לתוך פני השטח של כל אחד מהלוחות כדי לשמש כקורלים עבור הגנוטיפים השונים או קבוצות הטיפול של התולעים. אוחזים כל טבעת במלקחיים, ומחממים בלהבה (להבה חזקה ממבער בונזן עובדת היטב) במשך כ-3 שניות. הניחו מיד את הטבעת על צלחת תוך כדי החזקת הטבעת עם המלקחיים כדי למנוע ממנה 'לדלג'.
         1. ודא שהטבעת מונחת שטוחה על פני השטח של האגר על ידי לחיצה עדינה כלפי מטה עם המלקחיים במספר נקודות על הטבעת. בעת הנחת הטבעת, יש להקפיד להשאיר מקום לשלוש טבעות נוספות.
         2. המיסו את שלוש טבעות הנחושת הנוספות על פני השטח של הצלחת, ודאגו למקם אותן קרוב ככל האפשר זו לזו, כך שכל הארבע יהיו בשדה הראייה של המצלמה.
            NOTE: ביצוע חותם טוב עם אגר הוא חיוני כדי לשמור על התולעים בטבעות במהלך הבדיקה. טבעות שמדלגות על הצלחת לא צפויות לעשות את האטימה הנכונה עם האגר ועלולות לצלק את האגר, מה שמאפשר לתולעים להתחפר ומפריע לדמיין את התולעים.
         3. לכל צלחת בדיקה הכינו צלחת "התאקלמות" נלווית, אותה יש לייבש ולא לזרוע ולא תקבל אתנול. הניחו ארבע טבעות נחושת על לוחות אלה.
      4. תייגו את תחתית הלוחות ליד כל טבעת בזן התולעת שישמש בטבעת, תוך הקפדה שלא לכתוב בשדה הראייה של הטבעת עצמה. התאם את התוויות שעל צלחת הבדיקה ללוחית ההתאקלמות הנלווית אליה.
      5. חשב את הסכום של 100% אתנול להוסיף לכל צלחת בדיקה כך הריכוז הסופי הוא 0 mM או 400 mM אתנול (משקל לנפח). עבור כל ניסוי (n = 1), תהיה צלחת אתנול אחת 0 mM וצלחת אתנול אחת 400 mM; לוחיות אקלום אינן מקבלות אתנול. מוסיפים את האתנול, pipeting אותו סביב פני השטח של הצלחת. השתמש בסרט מעבדה כדי לאטום את הצלחת ולאפשר לה להתאזן על ראש הספסל למשך שעתיים.
      6. לאחר שחלפה שעה וחצי, התחל את שלב ההתאקלמות של הבדיקה, שלב 2.2.
   2. ביצוע בדיקת תנועה: לוחות Assay
      1. מעבירים בזהירות 10 תולעים מכל קבוצת ניסוי למרכז טבעת נחושת על צלחת ההתאקלמות. הסר כל מזון הנראה על האגר בשלב זה על ידי גירוד עדין עם קוטף התולעים. שנו את הסדר שבו קבוצות הניסוי מונחות על הצלחות לאורך ניסויים ניסיוניים, כך שאותם זנים לא יונחו על הצלחות באותו סדר לאורך הניסויים.
         NOTE: המטרה היא להעביר את בעלי החיים לצלחת עם כמויות מזון מינימליות, כי אם המזון על צלחת האקלום מועבר לצלחת הבדיקה התולעים יצטברו סביב המזון והשפעת התרופה על התנועה תיטשטש.
      2. היזהרו לא לשבור את פני השטח של האגר עם הפיק, שכן זה יאפשר לתולעים להתחפר וישבש את הבדיקה. לדגור על התולעים ב-RT במשך 30 דקות.
      3. ודא שיש מרווח מתאים בין החניכות של כל צלחת. נסיין מנוסה יכול להזיז 40 בעלי חיים, 10/טבעת עבור 4 טבעות < 1.5 דקות, אבל כל מרווח של עד 2 דקות מקובל. הבדיקה הסטנדרטית כוללת הקלטת סרטים בחשיפה של 10-12 דקות ו-30-32 דקות עבור אתנול של 0 מילימטר ו-400 מילימול.
      4. הפעל את לוחית ההתאקלמות עבור החשיפה של 0 מילימטר ואת לוחית ההתאקלמות עבור החשיפה של 400 מילימטר במרחק של כ- 2 דקות ו- 30 שניות זו מזו, כדי לאפשר שמירה של קובץ הסרט הראשון לפני שהסרט השני חייב להתחיל.
      5. לאחר תקופת ההתאקלמות של 30 דקות, העבירו את התולעים מלוחות ההתאקלמות ללוחות הבדיקה. מעבירים את התולעים לצלחות הבדיקה (0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול) באותו סדר שבו נוספו לצלחת ההתאקלמות, תוך מעקב אחר העיתוי בין השלמות כל לוחית. אטמו את הצלחת בסרט מעבדה כדי למזער את אובדן האתנול לאידוי.
      6. השתמשו בתנועת גריפה עם פיק תולעים שטוח בעל שוליים דקים כדי לאסוף תולעים על גבי הקוטף השטוח. בצע את העברת התולעים מצלחת האקלום unseeded לצלחת הבדיקה ללא שימוש בחיידקים, אשר משמש בדרך כלל בהעברת תולעים כפי שהוא עוזר להדביק את התולעת לבחור.
         NOTE: המהירות שבה בעלי חיים מועברים בשלב זה חשובה מאוד מכיוון שהתולעים הראשונות על הצלחת ייחשפו לאתנול זמן רב יותר מאשר התולעים האחרונות שנוספו לצלחת, ונקודות זמן מוקדמות יותר עשויות להראות כמה השפעות תלויות זמן. זו הסיבה העיקרית לסיבוב, אילו זנים מונחים על צלחת תחילה על פני העתקים ניסיוניים.
   3. ביצוע בדיקת תנועה: צילומים
      1. השתמש בשילוב מיקרוסקופ/מצלמה המאפשר הדמיה בו זמנית של כל ארבע הטבעות בשדה הראייה (בערך 42x42 מ"מ² ריבוע), כגון מטרת מיקרוסקופ 0.5x, הגדלה של 0.8x ומצלמה עם 2048x2048 7.4 מיקרומטר פיקסל CCD.
      2. השתמש בתאורה אחידה על פני שדה הראייה, המסייעת בזיהוי אובייקטים בשלב סף העוצמה. תאורה אחורית בגודל 3X3 פועלת היטב.
      3. דמיינו את התולעים על לוח הממוקם בצד המדיה כלפי מעלה (מכסה כלפי מטה), מה שיוצר ניגודיות שאובדת בעת שימוש בתאורה האחורית בהשוואה למקור אור מסורתי המשודר במיקרוסקופ.
      4. הכן את תוכנת ניתוח התמונות כדי לצלם סרטים בהילוך מהיר של התולעים הנעות. הגדר את התוכנה לצילום תמונות בקנה מידה אפור של 12 סיביות כל שנייה, כסרט של 2 דקות (120 פריימים). כדי להקטין את קובץ הפלט, תוך שמירה על רזולוציית תמונה מספקת, השתמש במצב בינינג 2x2 כדי ללכוד תמונות בגודל 1024x1024 פיקסלים.
      5. הקלט את הסרטים. התחל להקליט סרט בן 120 פריימים של הצלחת הראשונה (0 מ"מ אתנול) 10 דקות לאחר שהתולעים האחרונות הונחו על הצלחת. שמור את קובץ הסרט.
      6. הקלט את הצלחת השנייה (אתנול 400 mM). חזור על תהליך זה עבור שתי הצלחות החל מ- 30 דקות לאחר שהונחו התולעים האחרונות על הצלחת הראשונה (0 mM אתנול) כדי ללכוד את נקודות הזמן של 30-32 דקות עבור כל חשיפה.
         NOTE: הקדישו מספיק זמן לשמירת קבצי התמונה לאחר כל הפעלת לכידה לפני תחילת ההקלטה של הלוח הבא לניתוח.
      7. להגהה עתידית של סרטים המאוחסנים בארכיון וכדי לאפשר פתיחה וניתוח של סרטים אלה על-ידי תוכנות הדמיה אחרות בקוד פתוח, כגון ImageJ, המר עותק של כל סרט לקובצי TIFF בקנה מידה אפור של 8 סיביות 256.
         NOTE: תוכנת ניתוח התמונות המתוארת כאן משתמשת בתבנית קובץ קניינית.

חומרים