$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. יצירת ממוספרות ראשוניות מקווי תאים של סרטן השד האנושי
הערה: בצע את השלבים הבאים תחת מכסה מנוע של תרבות סטרילית.
- הכינו מדיה ממוספירית המכילה DMEM/F12 בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/ml פניצילין, 100 U/ml סטרפטומיצין. יש להכין מדיה מלאה מיד לפני השימוש על-ידי הוספת 20 נ"ג/מ"ל גורם גדילה רקומביננטי של האפידרמיס האנושי (EGF; Sigma), 10 ng/ml גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי רקומביננטי (bFGF; מערכות מו"פ) ותוספת B27 אחת.
- יש לשאוף מדיה מבקבוקון המכיל תאי MCF-7 או MDA-MB-231 דבקים (או קו תאים לסרטן השד לבחירתך; מפגש של 70-80%), לשטוף פעמיים ב-PBS 1x ולהתאים טריפסיניזציה.
- תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. דקאנט supernatant ותאי השהיה מחדש ב 1-5 מ"ל של מדיה ממוספירה. פיפטה למעלה ולמטה ובמידת הצורך השתמש במסנן מכסה מסננת תא 40 מיקרומטר כדי לקבל מתלה תא יחיד. השתמש בהמוציטומטר כדי להבטיח שנוצר תרחיף של תא בודד (אם לא, השתמש במחט 25 גרם כדי להזריק את תרחיף התא עד 3 פעמים).
- במידת הצורך, בודד CD44+CD24- תת-קבוצה תאית באמצעות FACS באמצעות נוגדנים חד-שבטיים נגד CD24-פיקואריתרין (PE) ואנטי-CD44-fluorescein isothiocyanate (FITC)9. לחלופין, בודד אוכלוסייה כזו באמצעות מערכת מיון תאים המופעלת מגנטית (MACS) עם מיקרו-כדוריות משולבות אנטי-CD44 ואנטי-CD24-ביוטין בהתאם להוראות היצרן. בצע ברירה חיובית באמצעות עמודות LS, ובחירה שלילית באמצעות עמודות LD ואשר את הפנוטיפים של כל התאים המבודדים על ידי ציטומטריית זרימה.
- חשב את מספר התאים קיימא למ"ל באמצעות trypan blue.
הערה: כדאיות התא מחושבת כמספר התאים בני קיימא חלקי המספר הכולל של תאים בתוך הרשתות על המוציטומטר. תאים שקולטים טריפאן כחול נחשבים לבלתי קיימא. ההליך הבא משמש לקביעה מדויקת של שיעור התאים בני קיימא.
- הכינו תמיסה של 0.4% של טריפאן כחול ב-PBS. הוסף 0.1 מ"ל של תמיסת טריפאן בלו סטוק ל -1 מ"ל תאים. יש להעמיס המוציטומטר ולבחון מיד תחת מיקרוסקופ בהגדלה נמוכה. ספור את מספר התאים הכולל ואת מספר התאים הצביעה הכחולה. תאים קיימא = [1.00 – (מספר התאים הכחולים ÷ מספר התאים הכולל)] × 100.
- כדי לחשב את מספר התאים בני קיימא למ"ל תרבית, השתמש בנוסחה הבאה. זכור לתקן עבור גורם הדילול.
מספר תאים ברי קיימא × 104 × 1.1 = תאים/תרבית מ"ל
- להשהות כמות קבועה מראש של תאים ב 2 מ"ל של מדיה ממוספירה מלאה בכל באר של צלחת 6-טוב אולטרה נמוך דבק. צפיפות הזריעה היא בדרך כלל 500-4,000 תאים לסמ"ר2 תאים לבאר. לחלופין, השתמש בצלחות 24 בארות עם חיבור נמוך תוך זריעת תאים באותה צפיפות ב- 0.5 מ"ל של מדיה.
הערה: אנו ממליצים על אופטימיזציה של צפיפות הזריעה וזמן התרבית עבור כל קו עניין של תא.
- לדגור על צלחות 6 בארות בעלות חיבור נמוך במיוחד ב-37°C ו-5% CO2 למשך 5-10 ימים (תלוי בקו התא ובגודל הממוספירות) מבלי להפריע לצלחות, במיוחד בשלב הצמיחה של 5 הימים הראשונים.