טרנסדוקציה לסימון תאי גידול PDX: החדרת סמן פלואורסצנטי המבטא Lentivirus לתא הגידול במבחנה

תקציר

מקור: Hanna, C., et al. תיוג של Xenografts שמקורם בסרטן השד עם כתבים הניתנים למעקב למחקרי צמיחת גידולים וגרורות. J. Vis. Exp. (2016).

הסרטון הבא מתאר טכניקה של התמרה לתווית (xenografts) תאי גידול PDX, המשמשת להחדרת לנטיוירוס המבטא חלבון ירוק-פלואורסצנטי ולוציפראז לתא הגידול במבחנה.

פרוטוקול

1. התמרה של תאי גידול שמקורם ב-PDX

1. צנטריפוגה תאי גידול מנותקים ב 300 גרם x 5 דקות ו resuspend ב 2 מ"ל ממוספירה מדיה. ספירת תאים בני קיימא באמצעות הרחקת טריפאן כחול (השעיה מחדש של תאים מעוכלים במאגר כביסה של 5 מ"ל וספירת תאים בני קיימא ושאינם בני קיימא באמצעות הרחקת כחול טריפאן. בקצרה, לערבב 50 μl של תאים ו 50 μl של כחול טריפאן ולספור טריפאן-כחול למעט תאים באמצעות המוציטומטר).
2. להכין 10 מ"ל של מדיה ממוספירה המכילה 8 מיקרוגרם / מ"ל פוליברן (2 מיקרוליטר של פוליברן מלאי לכל מ"ל של מדיה).
3. לקבוע את הנפח הדרוש עבור 2 x 10⁵ תאים סרטניים קיימא. תאי צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות, ו resuspend pellet ב 2 מ"ל של פוליברן המכיל מדיה. צלחת 2 x 10⁵ תאי גידול קיימא לכל באר בצלחת תרבית רקמה 6 בארות היצמדות נמוכה במיוחד.
   הערה: זהו מספר אופטימלי של תאים הדרושים להתמרה עם וקטור לנטיויראלי אחד.
   זהירות!חלקיקים לנטי-ויראליים וכל החומרים המתכלים המשמשים עם חלקיקים לנטי-ויראליים צריכים להיות מטופלים בהתאם להליכים מוסדיים עבור סיכונים ביולוגיים רקומביננטיים של DNA.
   הערה: התמרה לנטיויראלית של תאי שד ראשוניים מעדיפה מאוד תאי מיואפיתל, מה שעלול לגרום לתיוג לקוי של תאים לומינליים ולבחירת תת-אוכלוסיות של תאי גידול במהלך התיוג.
4. לדגור על הנגיף עם 200 mU/ml neuraminidase ב 37 ° C במשך 1 שעה לפני התמרה כדי להגביר את הקישור של חלקיקים נגיפיים לתת-אוכלוסיות תאים ראשוניות שונות ולתקן את ההטיה הפוטנציאלית הזו.
5. הוסף חלקיקים לנטי-ויראליים ב- 10 MOI (2 x 10⁶ TU עבור 2 x 10⁵ תאים ברי קיימא) אם תאים מנותקים PDX מתרוקנים מתאי עכבר Lin+ או מועשרים בתאי EpCam+ . הוסף חלקיקים לנטי-ויראליים ב- 30 MOI (6 x 10⁶ TU עבור 2 x 10⁵ תאים ברי קיימא) אם אתה משתמש בתאים לא מועשרים PDX-dissociated.
   הערה: MOI מוגבר מאפשר התמרה יעילה גם בנוכחות כמויות גדולות של פסולת ותאים מתים בתמציות גולמיות. שמור היטב אחד עם תאים לא מסומנים כדי לשמש בקרה עבור כדאיות ויעילות התמירה.
6. מערבלים כדי לערבב וירוס עם תאים. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ למשך עד 96 שעות. הוסף 500 μl של מדיה ממוספירה טרי 24 שעות לאחר transfection. תאים לא יתחברו לצלחות, לא ישאפו מדיה.

2. הערכת יעילות ההתמרה והשתלה מחדש של תאים מסומנים בעכברים מדוכאי חיסון

1. נטר את ביטוי הסמן הניתן למעקב (GFP) כל 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 10.
   הערה: ניתן לראות ביטוי GFP כבר 24 שעות לאחר ההדבקה, אולם ברוב PDX ביטוי GFP נראה בבירור לאחר 72 שעות (איור 1).
2. להעריך את יעילות הטרנסדוקציה על ידי הערכת אחוז תאי GFP+ בתוך סך כל הבאר.
   הערה: מאחר שתרביות מכילות תאים סרטניים, תאי סטרומה שיוריים ותאים מתים בדרגות שונות, בארות עם תאי GFP+ נמוכים של עד 10% יכולות להיות מושתלות בעכבר מארח.
3. מעבירים תאים מותמרים מצלחות 6 בארות לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של מדיה ממוספירה לבאר כדי לאסוף את כל התאים שנותרו מאחור. מניחים על קרח.
4. הוסף 10 מ"ל של HBSS/hepes לתאים מותמרים וצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות, 4 ° C. בזהירות לשאוף supernatant ו resuspend ב 50 μl מרתף מטריצת לחלץ (BME) על ice.
   הערה: עלי BME חייבים להיות מופשרים על קרח, 1 - 2 שעות לפני השימוש. BME יתמצק בטמפרטורת החדר; יש לשמור על קרח בכל עת.
5. טען תאים משובצי BME לתוך מזרק אינסולין של 0.5 מ"ל, שמור על קרח והבא למתקן בעלי החיים להשתלה מחדש בעכברי NSG.

תוצאות

איור 1: מעקב אחר יעילות ההעברה בתאי PDX מנותקים. A) תאים מנותקים PDX מועשרים עבור תאי אפיתל אנושיים (דלדול Lin+) 24 שעות לאחר התמרה עם חלקיקים lentiviral pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro. B) תאים מנותקים PDX מניסוי נפרד, ללא העשרת תאי אפיתל, 72 שעות לאחר התמרה עם pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. שתי החלוניות מציגות תאים חיים. BF: תמונות שדה בהיר, הסרגל מייצג 50 מיקרומטר

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM/F12 (1:1)	היקלון	SH30023.01
bFGF	BD Biosciences	354060
EGF	BD Biosciences	354001
הפארין	סיגמא	H4784
B27	גיבקו/תרמו פישר	17504-44
אנטי פטריות-אנטיביוטיקה	היקלון	SV30010
HBSS אדום Ca2 + / Mg2+ חינם	היקלון	SH30031.02
Hepes
קולטרקס	קולטרקס	3433-005-01	תמצית מטריצת מרתף (BME)
30°C שייקר	NewBrunswick סיינטיפיק ושות' INC	שייקר חממה סדרה 25