גידול משותף של תאי BC: טיפוח תאי סרטן השד עם שברי עצם לחקר התפשטות תאים סרטניים

תקציר

מקור: Templeton, Z. S., et al. שיטות לטיפוח צמחי רקמת עצם הירך האנושית לחקר התיישבות תאי סרטן השד בנישה גרורתית. J. Vis. Exp (2015).

סרטון זה מתאר את ההתרבות של תאי סרטן השד הסמוכים לצמחי עצם הירך כדי למדוד התפשטות והתיישבות של תאים סרטניים במערכת מודל צמחי רקמת עצם אנושית.

פרוטוקול

1. גידול משותף של תאי סרטן השד הסמוכים לשברי עצם למדידת התפשטות תאי שד באמצעות BLI

1. לפני הניסוי, הכינו תרחיף המכיל 2 x 10⁵ תאי סרטן השד / 50 מיקרוליטר, והכינו פקקים של שעוות עצם לשיתוק שברי עצם בתרבית. חתכו קצה מיקרופיפטה P200 ל-3 חתיכות והשתמשו בקצה הצר של החתיכה הגדולה ביותר באופן "חותך עוגיות" כדי לחתוך חתיכות קטנות (~35 מ"ג) של שעוות עצם. השתמשו בקצה הרחב של החתיכה הקטנה ביותר כדי להוציא את פקקי שעווה העצם לתוך צלחת פטרי לאחסון.
2. מניחים פיסת שעוות עצם במיקום השעה 12 של כל באר ולוחצים בעדינות כלפי מטה עם אצבע מורה סטרילית בכפפה.
3. פיפטה 50 μl של תרחיף תאים המכיל 1 x 10⁵ תאי סרטן השד DMEM-10% FBS + Pen-Strep במרכז כל באר של צלחת 6 באר. (לחלופין, תאי זרע בתבנית מפוזרת אם רוצים.) הניחו את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות כדי לקדם את חיבור התאים.
4. הניחו שבר עצם אחד על חתיכה אחת של שעוות עצם עבור כל באר ניסיונית והפעילו לחץ עדין עם הרונגר כדי לאבטח אותו. בצע ניסויים בטריפליקט כך ש-3 שברי עצם מדגימת THR נתונה ימוקמו בשלוש הבארות העליונות, בעוד ששלוש הבארות התחתונות מכילות שעוות עצם רק כבקרה.
5. באמצעות פיפטה 5 מ"ל, בעדינות ובאיטיות לספק 5 מ"ל של DMEM-10% FBS לצד של כל באר כדי למנוע עקירה של תאי השד או שברי עצם. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית רקמה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20-24 שעות.
6. כדי לבצע הדמיה ביולומינסצנטית (BLI) יש להסיר את הצלחת מהאינקובטור ולהוסיף מצע לוציפרין (כדי להגיע לריכוז של 300 מיקרוגרם/מ"ל) לכל באר. צלם את הלוח באופן מיידי על פלטפורמת הדמיה IVIS באמצעות הפרמטרים הבאים: f-stop של 1, binning קטן, זמן חשיפה של 1 שניות, רמה D. מדוד את עוצמת האות של כל באר וכן קרינה ממוצעת (פוטונים/שנייה/סנטימטר מרובע/סטרדיאן).
7. השתמש בתוכנת הדמיה כדי להגדיר אזורי עניין (ROI) כדי לכמת את הקרינה הממוצעת עבור כל בארות הניסוי והבקרה. יצא ערכי זוהר ממוצעים לגיליון Excel כדי לבצע סטטיסטיקה וליצור גרפים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	לייף טכנולוגיות	10569-010	השלם את כל DMEM עם 10% סרום בקר עוברי ו 1% עט / Strep
סרום בקר עוברי	לייף טכנולוגיות	16000-044
פניצילן סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140-122
D-לוציפרין גחלילית, מלח אשלגן 5 גרם (30 מ"ג/מ"ל)	לייף טכנולוגיות	L-8220
6 אשכול תרביות תאים מטופל היטב TC	קורנינג מאוגדת	3516
פרידמן-פירסון רונגור	כלים מדעיים משובחים	16021-14
שעוות עצם	תאגיד התמחויות כירורגיות	903
פלטפורמת הדמיה IVIS 50	קליפר מדעי החיים/פרקיןאלמר
תאי סרטן שד MCF-7	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 תאי סרטן השד	ATCC	HTB-26