מדיום מותנה איברים: יצירת תווך מתאי איברים שנקטפו למחקרי סרטן גרורתי

תקציר

מקור: Piaseczny, M. M., et al. דור של מדיה מותנית איברים ויישומים לחקר השפעות ספציפיות לאיברים על התנהגות גרורתית של סרטן השד. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר שיטה ליצירת מדיום מותנה באיבר הנגזר מכבד העכבר. מערכת מודל זו יכולה לשמש לזיהוי ומחקר של גורמים מסיסים שמקורם באיברים והשפעתם על טרופיזם איברים והתנהגות גרורתית של תאים סרטניים.

פרוטוקול

1. יצירת מדיה מותנית ריאות ומוח

1. בתרבית רקמה סטרילית, יש להפוך את צינורות PBS המכילים ריאה או מוח שלוש פעמים כדי להסיר שאריות דם מאיברים ולשאוף PBS המכיל דם. יש לחזור על הפעולה עם PBS קר טרי עד שהתמיסה נראית צלולה ללא עדות לדם.
2. הניחו את הריאות והמוח בצלחות פטרי נפרדות מזכוכית בגודל 60 מ"מ. באמצעות שני להבי אזמל סטריליים, טחון ריאות או מוח על ידי חיתוך חוזר ונשנה קדימה ואחורה עד ששברי רקמות הם בערך ~ 1 מ"מ 3 בגודל.
3. קבע את כמות המדיה הדרושה להשעיה מחדש של שברי רקמות מהפרש המשקל המחושב.
   הערה: משקל רקמת הריאה והמוח מנורמל על ידי השעיה ביחס מדיה:רקמה של 4:1 (vol/wt).
4. השהה מחדש מקטעי רקמה בנפח המתאים (שנקבע קודם לכן בשלב 1.3) של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של Dulbecco: מדיה F12 בתוספת תוסף מיטוגן מרוכז 1x ופניצילין (50 מיקרוגרם / מ"ל) / סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם / מ"ל).
5. הוסף שברי ריאות או רקמת מוח תלויים לבאר אחת של צלחת 6 בארות.
6. לדגור על שברי רקמה במדיה במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר הדגירה, יש לאסוף מדיה מותנית לכל רקמה ולדלל עוד יותר על ידי הוספת שלושה נפחים שווים של מדיה טרייה בצינור חרוטי של 50 מ"ל.
7. צנטריפוגה ב 1,000 x גרם במדיה ממוזגת מדוללת עבור כל איבר ב 4 ° C במשך 15 דקות כדי להסיר פסולת רקמות גדולות. יש לאסוף חומרי הדפסה ולסנן דרך מסנן מזרקים בגודל 0.22 מיקרומטר.
8. מדיה ממוזגת מכל איבר (כלומר, ריאה עם ריאה ומוח עם מוח) מעכברים מרובים כדי להסביר את השונות בין העכבר לעכבר. Aliquot ולאחסן מדיה ממוזגת ב -80 ° C עד לשימוש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1x מלח חוצץ פוספט	תרמופישר סיינטיפיק	10010-023	שמור על סטריליות
60 מ"מ2 צלחות פטרי זכוכית	סיגמא-אולדריץ'	CLS7016560	שמור על סטריליות
DMEM:F12	לייף טכנולוגיות	21331-020	יש לחמם באמבט מים בטמפרטורה של 37°C לפני השימוש, לשמור על סטריליות
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/ml)	לייף טכנולוגיות	15140-122	שמור על סטריליות
50 מ"ל צינורות חרוטיים	תרמו-סיינטיפיק (Nunc)	339652	שמור על סטריליות
מסנני מזרק 0.22 מיקרומטר	סיגמא-אולדריץ'	Z359904	שמור על סטריליות
צלחות תרבית רקמה 6 בארות	תרמו-סיינטיפיק (Nunc)	140675	שמור על סטריליות
להבי אזמל	פישר סיינטיפיק	S95937A	שמור על סטריליות