דיסוציאציה מכנית: שיטה להשגת תאים בני קיימא מרקמה

תקציר

מקור: Garaud et. al., פרוטוקול פשוט ומהיר לניתוק לא אנזימטי של רקמות אנושיות טריות לניתוח לימפוציטים חודרים. J. Vis. Exp. (2014).

סרטון זה מתאר את הדיסוציאציה הלא-אנזימטית של רקמה אנושית טרייה להשגת תאים בני קיימא. הטכניקה משמשת לניתוח איכותי וכמותי של תאים חיוביים CD45 (לימפוציטים / לויקוציטים) הנמצאים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות.

פרוטוקול

1. הכנת הרקמה הומוגנט

1. רקמות מנותחות (רקמה ממאירה ותקינה המנותחות מחדר הניתוח) נמצאות במעבדה הפתולוגית על ידי צוות מיומן לאיסוף מיידי. גידול, NANT (נלקח מרחק רב ככל האפשר מהגידול) ושברי רקמות נורמליים מעובדים באופן שגרתי תוך 1 - 3 שעות של כריתה כירורגית במעבדת BSL2 באמצעות נהלי בטיחות ביולוגית סטנדרטיים לרקמות אנושיות. תרשים זרימה של הפרוטוקול מומחש באיור 1.
2. לשקול את כל שברי הרקמה (נורמלי, NANT וגידול) ולמדוד את אורך, רוחב, וגובה (אורך x רוחב x גובה). זהו צעד חשוב לנורמליזציה הבאה של תת-אוכלוסיות תאים, RNA מופק וכו '<br / > הערה: טווח גודל המדגם הוא 100 עד 10,000 מ"מ³ ללא שומן במידת האפשר.
3. הטביעו את שבר הגידול על שקופית זכוכית לצביעת H&E כדי לוודא שהרקמה היא אכן חלק מהגידול.
   1. עשו זאת על ידי לחיצה על שקף מיקרוסקופ זכוכית על שבר הגידול והפעלת לחץ עדין עם האצבעות למשך מספר שניות.
   2. תקן את המגלשה עם איזופרופנול למשך 2 דקות ולאחר מכן שלב שטיפה במים. מכתימים את הרקמה למשך 30 שניות עם המטוקסילין של מאייר.
   3. שטפו את המגלשה בשש אמבטיות מים. מכתים בפלוקסין B 2% למשך 15 שניות.
   4. לשטוף באמבטיה אחת של מים ואחריה ארבע אמבטיות של isopropanol ולסיים עם אמבטיה אחת של מים.
   5. יש לדגור באיזופרופנול למשך דקה ולסנן. ברור בשתי אמבטיות של xylene.
   6. הר עם אמצעי הרכבה מבוסס קסילן. בדיקת תאים סרטניים (איור 2).
      הערה: בעיקר, תאי הגידול נדבקים לשקופית המוטבעת - תאי הסטרומה, הלימפה או השומן נשארים לעתים רחוקות, ומשאירים רווחים בין תאי הגידול (איור 2).
4. מניחים את שבר הרקמה בכלי תרבית קטן המכיל 1 מ"ל של תווך התא ההמטופויטי המוגדר כימית ונטול הסרום (להלן מדיום) בטמפרטורת החדר וחתוך אותו לחתיכות קטנות (~ 1 - 2 מ"מ²) באמצעות אזמל סטרילי.
5. מעבירים הכל (שברי רקמות + מדיום) לצינור C דיסוציאטור מכני.
6. שוטפים את צלחת הפטרי והאזמל ב-2 מ"ל מדיום באמצעות פיפטה של פסטר ומוסיפים זאת לצינור C (נפח המדיום לדיסוציאציה = 3 מ"ל).
7. השתמש בתוכנית הדיסוציאטור המכנית A.01 עבור צינורות C (התוכנית העדינה ביותר) כדי הומוגניזציה של שברי הרקמה לתרחיף תא יחיד. מקם את צינור C במנגנון והפעל את התוכנית פעמיים ברציפות (מחזור אחד = 25 שניות).
   הערה: הליך הומוגניזציה זה הוקם ואומת עבור רקמת שד אנושית, ייתכן שיהיה צורך להשתמש בסוגי גידול או רקמות אחרים להשתמש בתוכנית אחרת ויש לבדוק אותם תחילה.
8. הסר את צינור C מהמנגנון ורוקן את ההומוגנט ישירות לתוך מסננת תא 40 מיקרומטר היושב על צינור 50 מ"ל. באמצעות אותה פיפטת פסטר כמו בשלב 1.6, להעביר את כל הנוזל שנותר בצינור C למסננת התא.
9. מעבירים את הנוזל המסונן לצינורית של 15 מ"ל באמצעות קצה מיקרופיפטה של 1 מ"ל. שמור באופן זמני את מסננת התא ואת צינור 50 מ"ל שלה.
10. שטפו את צינור C עם 3 מ"ל נוספים של מדיום והעבירו את זה, שוב באמצעות אותה פיפטת פסטר כמו בשלב 1.6, למסננת התא שעדיין יושבת על צינור 50 מ"ל. סחטו כמות מקסימלית של הנוזל השיורי הכלוא ברקמה הלא הומוגנית לתוך הצינור של 50 מ"ל על ידי הזזתו בעדינות סביב המסננת עם פיפטה נקייה של פסטר או קצה של 1 מ"ל שנזרק לאחר מכן כדי למנוע זיהום של הפולט.
11. הניחו את מסננת התא הפוכה על צינור C המקורי ושטפו עם 3 מ"ל של מדיום, כך שהרקמה הלא הומוגנית תרד חזרה לתוך צינור C.
12. הומוגניזציה מחדש כמו בשלב 1.7 עבור שני מחזורים של תוכנית A.01.
13. יוצקים את ההומוגנט השני דרך מסננת התא היושבת על צינור 50 מ"ל, שוטפים שוב את צינור C עם 3 מ"ל בינוני (כמו בשלב 1.10) ומעבירים עם פיפטת פסטר למסננת התא היושבת על צינור 50 מ"ל שוב לסחוט כמות מקסימלית של נוזל מרקמת החיבור השיורית הכלואה במסננת התא.
14. בשלב זה, נפח של ~ 2.5 מ"ל נמצא בצינור 15 מ"ל ו~ 9 מ"ל בצינור 50 מ"ל.

2. הפרדת הרקמה והתאים

1. צנטריפוגה הומוגנטים בצינורות 15 מ"ל ו 50 מ"ל במשך 15 דקות ב 600 x גרם בטמפרטורת החדר.
2. רוקן את ה- SN מצינור 15 מ"ל לתוך צינור נקי ולאחסן באופן זמני ב 4 ° C. סופרנאטנט זה = גידול ראשוני, NANT או רקמה נורמלית SN (נפח סופי 2.5 מ"ל) מובהר לאחר מכן וחוזר לפני האחסון ב -80 מעלות צלזיוס לניתוחים עתידיים (ראה להלן).
3. יש להשליך את הסופרנאטנט מצינור ה-50 מ"ל.
4. יש להשהות מחדש בעדינות את שתי כדוריות התא בנפח סופי של 1 מ"ל בינוני. בקצרה, תחילה לשבור בעדינות את גלולת התא בשני הצינורות (על ידי הקשה על הצינור על משטח קשה). להשהות מחדש את גלולת התא הרופפת ב 50 מ"ל עם 500 μl של בינוני ולהעביר את השעיית התא לצינור 15 מ"ל כדי להשעות מחדש את הגלולה השנייה. חזור על שלב זה פעם אחת עם השני 500 μl של בינוני להתאוששות מקסימלית של תאים.
5. להעביר 10 μl של תרחיף התא לצינור קטן, לערבב עם 10 μl של כחול טריפאן (דילול 1: 1) ולספור את מספר התאים קיימא באמצעות hemocytometer.
   הערה: בשלב זה ניתן לנתח חלק קטן מתרחיף התא גם על ידי ציטומטריית זרימה כדי להעריך את גודל התא, גרעיניות ואם תרצה מספר מוגבל של סמנים תת-אוכלוסייה להערכה מדויקת יותר של התפלגות התא היחסית בהומוגנאט לפני ניתוח או ניסויים מקיפים. כל הניתוחים לפי ציטומטריית זרימה משלבים תיוג CD45 לנורמליזציה של תת-אוכלוסיות.
6. מטילים את התאים בצנטריפוגה על 300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. התאים מהגידול, מ-NAT או מרקמה רגילה מוכנים כעת לטיהור או ניתוח נוספים. צעדים נוספים אלה הם הטובים ביותר כאשר מבוצעים באותו יום של ניתוח.
   הערה: לניתוח ציטומטרי של זרימה אך לא למיון תאים, יש לבצע ליזה של שאריות תאי דם אדומים לאחר תיוג נוגדנים על ידי הוספת 0.4 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים לכדורית התא, ערבול מיידי למשך שנייה אחת ודגירת מינימום של 10 דקות בטמפרטורת החדר (מוגן מפני אור) לפני הניתוח.

3. הבהרת העל-הרקמה

1. צנטריפוגה צינורות 1.5 מ"ל עם רקמה SN ב 15,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C.
2. הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי לגעת או להפריע לכדור. מעבירים לצינור נקי (או צינורות) בהתאם למספר ונפח aliquots הרצוי.
3. אחסנו את הסופרנאטנט בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה של פרוטוקול.הנוהל שלנו לעיבוד רקמות אנושיות טריות וכמה גישות אנליטיות שניתן להשתמש בהן לאחר מכן כדי להעריך לימפוציטים החודרים לרקמות אנושיות מוצגים.

איור 2: תמונה מוכתמת H&E של טביעת רקמת גידול בשד.חותם זה, שנלקח משבריר רקמת גידול שד טרי, מראה נוכחות של תאי גידול כאשר ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
GentleMacs Dissociator	Miltenyi ביוטק	130-093-235	BD Medimachine שווה ערך במקצת
צנטריפוגה 5810 R	אפנדורף		או צנטריפוגה סטנדרטית אחרת
צנטריפוגה 5417 R	אפנדורף		או מיקרו-צנטריפוגה סטנדרטית אחרת
Esco Class II A2 ארון בטיחות ביולוגית	אסקו גלובל		או מכסה מנוע BSL2 סטנדרטי אחר
מיקרוסקופ הפוך	ליקוי חמה Nikon TS100		או מיקרוסקופ אחר התואם להמציטומטר
Bürker Chamber Marienfield		640210	או המציטומטר סטנדרטי אחר
ציטומטר זרימה Navios	בקמן קולטר		או ציטומטר זרימה אחר (מומלץ 8-10 צבעים)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi ביוטק	130-096-344	BD Medimachine משתמשת ב-Filcon
צלחת תרבית תאים	זארשטדט	72,710	או כלי פלסטיק לא פירוגניים אחרים
אזמל חד פעמי	סוואן-מורטון	510	או אזמל סטרילי סטנדרטי לשימוש חד פעמי
מסננת תאי BD 40 מיקרומטר	בקטון דיקינסון	734-0002	או כלי פלסטיק לא פירוגניים אחרים
צינור פלקון BD 50 מ"ל	בקטון דיקינסון	352070	או כלי פלסטיק לא פירוגניים אחרים
BD Falcon Tube 15 מ"ל	בקטון דיקינסון	352097	או כלי פלסטיק לא פירוגניים אחרים
שפופרת BD FACS 5 מ"ל	בקטון דיקינסון	352008	או כלי פלסטיק לא פירוגניים אחרים
פיפטת פסטר סטרילית 5 מ"ל	VWR	612-1685	או כלי פלסטיק לא פירוגניים אחרים
שפופרת מיקרופוגה 1.5 מ"ל	אפנדורף	7805-00	או כלי פלסטיק לא פירוגניים אחרים
X-Vivo 20	לונזה	BE04-448Q	ללא סרום בינוני מומלץ
פוספט מלח חוצץ	לונזה	BE17-516F	PBS פיזיולוגי סטנדרטי
כחול טריפאן	VWR	17942E	או כתם חיוני אחר