בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה: שיטה לבדיקת השפעות של תרכובות חדשות על התפשטות תאים סרטניים

תקציר

מקור: Horibata A. et. al., שימוש בבדיקת היווצרות מושבת אגר רכה לזיהוי מעכבי גידולים בתאי סרטן השד. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מתאר בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה כדי לבדוק את ההשפעות של מעכב אנזים PADI ו- BB-Cl-amidine על גידולים בסרטן השד במבחנה. בדיקה זו מאפשרת גם הערכה כמותית של פוטנציאל התמרת התא בהקשר של הפרעות גנטיות.

פרוטוקול

1. הכנת 3% 2-הידרוקסיאתיל אגרוז

1. לתוך בקבוק זכוכית נקי ויבש 100 מ"ל, להוסיף 0.9 גרם של 2-hydroxyethyl agarose (Agarose VII) ואחריו 30 מ"ל של מים מזוקקים.
2. חממו את התערובת במיקרוגל למשך 15 שניות וערבלו בעדינות. חזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים נוספות עד שאבקת האגרוז מתמוססת לחלוטין.
3. יש לרכב את הבקבוק המכיל תמיסה למשך 15 דקות.
4. אפשר לתמיסת האגרוז להתקרר ל-RT לפני שימוש נוסף. אחסן את הפתרון ב- RT.

2. הכנת השכבה התחתונה: 0.6% ג'ל אגרוז

1. מחממים מראש מספר פיפטות 5 מ"ל ו -10 מ"ל באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס כדי למנוע מהאגרוז להתמצק בפיפטה בעת הטיפול.
2. שחררו חלקית את מכסה הבקבוק וחממו במיקרוגל את תמיסת האגרוז 2-הידרוקסיאתיל 2-הידרוקסיאתיל מוכנה מראש למשך 15 שניות. לאחר מכן, מערבלים בעדינות את התמיסה ומחממים במיקרוגל עוד 15 שניות.
   זהירות: היזהר בעת ערבול תמיסת האגרוז מכיוון שהתמיסה עולה כאשר היא נחשפת לאוויר ויכולה להישפך.
3. אם יש שאריות ג'ל מוצק בבקבוק, חממו במיקרוגל עוד כמה שניות.
4. שמור את הבקבוק המכיל את תמיסת האגרוז באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס במהלך השלבים הבאים כדי למנוע מתמיסת האגרוז להתמצק בטרם עת.
5. מדיה MCF10DCIS חמה באמבט מים 37 °C.
   הערה: מדיה MCF10DCIS מורכבת DMEM/F12, 5% סרום סוסים, 5% פניצילין סטרפטומיצין.
6. מעבירים 3 מ"ל מתמיסת האגרוז 3% באמצעות פיפטות שחוממו מראש לצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.
7. מיד להוסיף 12 מ"ל של מדיה MCF10DCIS חם בעדינות להפוך את הצינור החרוטי כדי לערבב את agarose עם התקשורת. נסו לא ליצור בועות מכיוון שזה יפריע לספירת המושבה מאוחר יותר.
8. מוסיפים בעדינות 2 מ"ל של תערובת זו לכל באר של צלחת תרבית 6 בארות מבלי ליצור בועות אוויר.
9. יש לדגור אופקית על צלחת התרבית בת 6 הבארות על משטח שטוח בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת כדי לאפשר לתערובת להתמצק.
10. לאחר שהתערובת מתמצקת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37°C למשך 30 דקות. השכבה התחתונה מוכנה כעת לשימוש.

3. הכנת השכבה המכילה תאים: 0.3% ג'ל אגרוז

1. טריפסיניזציה של MCF10DCIS תאים ודלל אותם לריכוז תאים של 4 x 10⁴ /ml.
2. קח 2 מ"ל של אגרוז 3% באמצעות פיפטות שחוממו מראש ולהעביר לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.
3. מיד להוסיף 8 מ"ל של מדיה MCF10DCIS לצינור חרוטי בעדינות להפוך כדי לערבב את agarose עם התקשורת. הימנעו מיצירת בועות.
4. יש ליטול 2 מ"ל מתאי MCF10DCIS (4 x 10,⁴ /מ"ל) ולטפל עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
5. בדילול של 1:1, מערבבים את התאים עם אגרוז 0.6%.
6. קח 1 מ"ל של תערובת התא-אגרוז ולהוסיף בעדינות על השכבה התחתונה של צלחת תרבית 6 בארות (2 x 10⁴ תאים / מ"ל).
7. הניחו את צלחת התרבית בעלת 6 הבארות אופקית על משטח שטוח בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות לפחות כדי לאפשר לשכבה העליונה להתמצק.
8. לאחר שהתערובת מתמצקת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שבוע לפני הוספת שכבת ההזנה.

4. הכנת שכבת ההזנה: 0.3% ג'ל אגרוז

1. חממו במיקרוגל את תמיסת האגרוז 2-הידרוקסיאתיל 2-הידרוקסיאתיל מוכנה מראש למשך 15 שניות. ערבלו בעדינות את התמיסה וחממו במיקרוגל במשך 15 שניות נוספות.
2. אזנו את בקבוק תמיסת האגרוז באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס.
3. חממו את אמצעי MCF10DCIS באמבט מים בטמפרטורה 37°C.
4. מערבבים 1 מ"ל של תמיסת אגרוז 3% עם 9 מ"ל של מדיה MCF10DCIS חמה לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל והופכים בעדינות כדי לערבב את האגרוז עם התקשורת. הימנעו מיצירת בועות אוויר.
5. יש לטפל בתערובת עם BB-CLA (0 מיקרומטר (DMSO) או 1 מיקרומטר).
6. מוסיפים בעדינות 1 מ"ל מתערובת זו (מבלי ליצור בועות) לכל באר של צלחת תרבית 6 בארות המכילה את השכבות התחתונות והרכות.
7. הניחו את צלחת התרבית בעלת 6 הבארות אופקית על משטח שטוח בטמפרטורה של 4°C למשך 15 דקות לפחות כדי לאפשר לתערובת להתמצק.
8. לאחר ששכבת ההזנה מתמצקת, מניחים את הצלחת באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
9. חזור על הליך הזנה זה מדי שבוע על ידי כיסוי 1 מ"ל של 0.3% אגרוז / בינוני / פתרון טיפול על שכבת ההזנה הקיימת כדי לחדש את התאים עם מדיה חדשה עד היווצרות המושבה הוא ציין.
   הערה: אגר בשכבות הרכות והמזינות הוא רך מאוד, ולכן החומרים המזינים הנוספים משכבת ההזנה יתפזרו בקלות לשכבה המכילה את התאים ויגיעו לתאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Zeiss Axiopot	קרל זיס מיקרוסקופיה	1021859251
מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס	CKX41
DMEM/F-12	לונזה ביוויטאקר	12-719F
HyClone תורם סרום סוסים	פישר סיינטיפיק	SH30074.03
פניצילין סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	15140-122
2-Hydroxyethylagarose: סוג VII, טמפרטורת ג'לינג נמוכה	סיגמא-אולדריץ'	39346-81-1