הזרקת ורידים בזנב: שיטה למתן תאים סרטניים למחקרים גרורתיים במודל עכבר

תקציר

מקור: Warren et. al., שימוש משולב בבדיקות גרורות ורידים בזנב והדמיית In Vivo בזמן אמת לכימות נשאות גרורתית של סרטן השד ועומס בריאות. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר טכניקה של הזרקת תאים סרטניים מסומנים באמצעות הזרקת ורידים בזנב למודל עכבר. אנו עוקבים גם אחר היווצרות גרורות וגדילה של סרטן השד באמצעות הדמיית בעלי חיים חיים בזמן אמת in vivo.

פרוטוקול

1. הזרקת וריד זנב של תאים סרטניים מסומנים

הערה: שלב 1.2.4 עבר אופטימיזציה עבור תאי 4T1 הגדלים בעכברי BALB/c סינגניים. אם נעשה שימוש בקווי תאים סרטניים אחרים וזני עכברים, יש למטב תחילה את מספר התאים המוזרקים ואת אורך הבדיקה.

1. הרחיבו את קווי התאים 4T1 שנוצרו בשלב 2 על שתי צלחות בקוטר 15 ס"מ במצע גדילה מלא, כך שתאים עודפים יהיו זמינים ביום ההזרקה.
2. הכינו את התאים להזרקת ורידים בזנב כדלקמן:
   1. שאפו את המדיה ושטפו את לוחות התאים עם 1x PBS.
   2. טריפסין את התאים עם 5 מ"ל של טריפסין לכל צלחת 15 ס"מ במשך 2-5 דקות (תאים צריכים לשטוף בחופשיות את החלק התחתון של הבאר). מעבירים את כל התאים לצינור חרוט. שטפו את התאים הנותרים מצלחת תרבית הרקמה עם מספיק מצע צמיחה שלם כדי להרוות את הטריפסין ולהוסיף את השטיפה לאותו צינור חרוט.
   3. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי כדי לקבוע את מספר התאים הכולל.
   4. צנטריפוגות את התאים ב 122 x g במשך 3 דקות, שואפים את supernatant, ו resuspend את התאים ב 1x PBS בריכוז הרצוי. כאן, 2.5 x 10⁴ תאים מוזרקים לכל עכבר ב 100 μL של PBS, כך תאי resuspend ב 2.5 x 10⁵ תאים / מ"ל. שמור את מתלי התא על קרח עד הזרקתו.
      הערה: חשוב להגביל את משך הזמן בין טריפסיניזציה של התאים לבין הזרקת וריד הזנב לכשעה.
3. הזריקו תאי 4T1 משלב 1.2.5 לעכברים דרך וריד הזנב הצידי באופן הבא:
   1. עבודה על מכסה מנוע במתקן בעלי חיים, בעדינות אך ביסודיות לערבב את התאים על ידי היפוך הצינור או באמצעות מזרק 1 מ"ל כדי להבטיח כי הם תלויים מחדש באופן אחיד. יש לוודא תמיד שהתאים מושהים מחדש לפני טעינת המזרק.
   2. טען מזרק Luer-lock בנפח 1 מ"ל עם מתלה תאים והרחק בועות אוויר עודפות. מניחים מחט בקוטר 1/2 אינץ' באורך 30 אינץ' על המזרק עם השיפוע כלפי מעלה ומוציאים בועות אוויר.
   3. הניחו את העכבר בעדינות בריסון מכרסמים.
   4. ורידי הזנב הרוחביים צריכים להיות גלויים ומורחבים. אם לא, צבטו בעדינות את בסיס הזנב וטבלו את הזנב במי ברז חמים כדי להרחיב את הוורידים.
      הערה: הרחבת הוורידים יכולה להיות מושגת גם על ידי הנחת כלוב העכבר מתחת למנורת חימום ו / או על גבי כרית חימום.
   5. השתמשו במגבון אלכוהול כדי לנקות את הזנב. הכנס את המחט לווריד הזנב, צד משופע כלפי מעלה, והזריק 100 μL של תרחיף התא.
      הערה: אם המחט מוחדרת כראוי לתוך הווריד, זה צריך בקלות להחליק מעט קדימה ואחורה, ולא צריכה להיות התנגדות כאשר הבוכנה נדחפת. הזרקות מוצלחות אמורות לגרום גם ל"סומק" שבו הצבע הכחול של הווריד הופך לבן למשך מספר שניות לאחר ההזרקה.
4. לאט להסיר את המחט באמצעות גזה סטרילית, להפעיל לחץ על אתר ההזרקה כדי לעצור כל דימום.
5. החזר את העכבר לכלוב שלו והצג במשך 15 דקות כדי להבטיח התאוששות מלאה. עכברים יש לבדוק סימנים של כאב או מצוקה 3 פעמים בשבוע.
6. עקוב אחר עכברים לאיתור היווצרות גרורות וגדילתן במשך 3-6 שבועות (תלוי בקו התא ובזן העכבר) באמצעות מכשיר הדמיה חי של בעלי חיים in vivo (ראה שלבים 1.5 ו-1.6).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2.5% טריפסין	גיבקו	15090-046	טריפסין לתרבית רקמות
מגבוני אלכוהול			לסטריליזציה של אתר ההזרקה לפני הזרקת ורידים בזנב
עכברי BALB/C (נקבה, 6 שבועות)	טאקונית	BALB-F	להתיישבות וריד זנב גרורתי ומבחני עומס
דולבקו&39; S פוספט מלח חוצץ	היימדיה	TS1006
EDTA	VWR	97061-406	משמש לדלל טריפסין לתרבית רקמות
FBS 100% ממוצא אמריקאי	VWR	97068-085	רכיב של מדיה צמיחה מלאה
ל-גלוטמין	גיבקו	25030-081	רכיב של מדיה צמיחה מלאה
תאי סרטן שד עכבר, 4T1	מכון קרמנוס לסרטן	אסלקסון, CJ ואח', 1992	קו תאי קונוס שד גרורתי של עכבר
פניצילין סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122	רכיב של מדיה צמיחה מלאה