מאמר שיטה

CTC Immunofluorescence Assay : טכניקה לאפיון תאי גידול במחזור הדם

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Garcia, J., et al. חצי אוטומטי PD-L1 אפיון וספירה של תאי גידול במחזור הדם מחולי סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים לפי אימונופלואורסצנציה.J. Vis. Exp.(2019)

סרטון זה מתאר את בדיקת Immunofluorescence Vaccinefluorescence של תאי הגידול במחזור הדם (CTC), טכניקה לאפיון הסמנים הביולוגיים על תאי גידול במחזור הדם בדגימות של חולי סרטן ריאות מסוג תאים שאינם קטנים. בדיקה זו יכולה לשמש למעקב אחר שינויים דינמיים של הגידול ותגובה חיסונית, אשר עשויים לשקף את התגובה לכימותרפיה, הקרנות וטיפולים אימונותרפיים אפשריים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צביעת אימונופלואורסנציה

  1. ספירה בשקופית עם רשת מסוג המוציטומטר את מספר התאים למ"ל. יש לדלל את הדגימה המועשרת בתמיסה נוגדת קישור 0.2% (טבלת חומרים) לריכוז המגיע ל-100,000 תאים/100 מיקרוליטר לציטוספין (cytospin).
  2. יש להרטיב את קווי המתאר של תא הדגימה באמצעות כותנה (Table of Materials) עם 50 μL של 0.2% תמיסת אנטי-קשירה. מניחים מגלשת זכוכית פוליליזין בתא הדגימה וסוגרים.
  3. מצפים קצה בתמיסה נוגדת קשירה של 0.2% על ידי צנרת למעלה ולמטה פי 3. משעים מחדש את הדגימה המועשרת ומעבירים את תמיסת התא לתא הדגימה. צנטריפוגה עם צנטריפוגה ייעודית (טבלת חומרים) ב-400 סל"ד למשך 4 דקות (תאוצה נמוכה).
  4. מניחים מבודד סיליקון סביב אזור התצהיר. הניחו לייבש את מגלשת הזכוכית מתחת לארון בטיחות מיקרוביולוגי למשך 2 דקות.
  5. הכן את פתרון הקיבוע על ידי דילול 1 מ"ל של 16% paraformaldehyde (PFA) עם 3 מ"ל של PBS סטרילי. יש להוסיף 100 μL של תמיסת קיבוע (4% PFA) לכל דגימה ולדגור ב-RT למשך 10 דקות. הסר את תמיסת הקיבוע ובצע שלוש שטיפות עם 200 μL של PBS ודגר ב- RT כל אחת למשך 2 דקות.
    אזהרה: יש להשתמש ב-PFA מתחת לארון בטיחות כימי למניעת שאיפה.
  6. הכינו את תמיסת הרוויה על ידי דילול סרום הבקר העוברי (FBS) ב-5%, מגיב חוסם קולטן Fc (FcR) ב-5%, ואלבומין בסרום בקר (BSA) ב-1% ב-PBS סטרילי (טבלת חומרים). הוסף 100 μL של תמיסת רוויה לכל דגימה ודגור במשך 30 דקות ב- RT. הסר תמיסת רוויה.
  7. הוסף 100 μL של תמיסת נוגדנים לכל דגימה (נוגדן CD45 1/20; נוגדן PanCK 1/500; נוגדן PD-L1 1/200; תמיסת רוויה Qsp 100 μL) (טבלת חומרים). הניחו את מגלשת זכוכית הפוליליזין בצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ. מרטיבים נייר סופג עם 2 מ"ל מים סטריליים וסוגרים את צלחת הפטרי עם המכסה. יש להניח על 4°C למשך הלילה ולהגן מפני האור.
  8. הסר את תערובת הנוגדנים ובצע 3 שטיפות עם 200 μL של PBS הדגירה כל כביסה במשך 2 דקות. תנו לדגימה להתייבש במשך 5 דקות והגנו עליה מפני האור. מניחים 10 μL של תמיסת הרכבה (טבלה של חומרים) באזור התצהיר ומכסים עם כיסוי מיקרוסקופ מבלי ליצור בועה. יש לאטום את הכיסוי בלק.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
F-68 פלורוני 10% גיבקו 24040-032פתרון אנטי מחייב. תנאי אחסון: טמפרטורת החדר
EZ Cytofunnels תרמופישרA78710003תא מדגם עם כותנה. תנאי אחסון: טמפרטורת החדר
צנטריפוגת שנדון ציטופסין4תרמופישר A78300003צנטריפוגה ייעודית. תנאי אחסון: טמפרטורת החדר
פרפורמאלדהיד 16%תרמופישר 11490570פתרון קיבוע. תנאי אחסון: +4°C
פוספט חוצץ מלוחים אולטרה טהור כיתה 1X – 1Lמעבדת הבסיס הראשונהBUF-2040-1X1Lתנאי אחסון: טמפרטורת החדר
סוכן חסימת FcR Miltenyi ביוטק130-059-901תנאי אחסון: +4°C
נוגדן חד שבטי PD-L1 (שיבוט 29E2A3) - פיקואריתריןביולג'נד BLE329706 תנאי אחסון: +4°C
נוגדן חד שבטי PanCK (שיבוט AE1/AE3) Alexa Fluor 488תרמופישר53-9003-80 תנאי אחסון: +4°C
נוגדן חד שבטי CD45 (שיבוט HI30) Alexa Fluor 647ביולג'נד BLE304020תנאי אחסון: +4°C
פלואורומאונט סיגמא F4680פתרון הרכבה. תנאי אחסון: טמפרטורת החדר
צלחת פטרידוטשר632180תנאי אחסון: טמפרטורת החדר
מלח חוצץ פוספט (PBS)אוזיםBE17-512Fתנאי אחסון: +4°C
שקופיות פוליליזין תרמופישרJ2800AMNZתנאי אחסון: טמפרטורת החדר
מבודד סיליקון גרייס ביו-מעבדות 664270תנאי אחסון: טמפרטורת החדר
מים סטריליים שעברו דה-יוניזציה – 100 מ"למעבדת הבסיס הראשונה CUS-4100-100 מ"ל תנאי אחסון: טמפרטורת החדר
סרום עגל עובר (FCS)גיבקו10270-106תנאי אחסון: +4°C

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PD L1PBS

מאמרים קשורים