אינפלציית אגרוז ריאה שלמה: שיטה להכנת ריאות להדמיית Ex vivo Live

תקציר

מקור: Van den Bijgaart R.J.E. et al., Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment, J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מתאר שיטה להכנת ריאות להדמיה חיה ex vivo לחקר אינטראקציות בין תאים סרטניים לתאי סטרומה, תוך שימוש באגרוז לאינפלציה. בפרוטוקול המדגם, הליך ניפוח אגרוז מתואר לפני צפייה באינטראקציות סלולריות חיות.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת ריאות להדמיה חיה Ex vivo

הערה: נסו לעבוד סטרילי וזהיר ככל האפשר כדי למנוע אתגרים מיותרים של תאי החיסון בתוך הריאות.

1. הזריקו לעכבר מנת יתר קטלנית של חומר הרדמה המותר על פי פרוטוקול בעלי החיים שאושר על ידי IACUC, למשל, 1 מ"ל של 2.5% אברטין. המתן עד שהעכבר יפסיק לנשום ויהיה לחלוטין לא מגיב לגירויים מזיקים (צביטת כף אחורית).
   הערה: יש להימנע מפריקת צוואר הרחם ומהמתת חסד של פחמן דו חמצני מכיוון שהיא עלולה להשפיע לרעה על יכולת הקיום של תאי הריאה.
2. לשתק את העכבר על לוח דיסקציה ולעקר את העכבר עם 70% אתנול.
3. השתמש מספריים כירורגיים כדי לבצע תחילה חתך epigastric רוחבי דרך העור, ואחריו חתך דומה דרך הצפק. החזיקו את לוח הדיסקציה במצב אנכי וחתכו את אבי העורקים היורד, כך שהדם יצטבר למטה בבטן ולא בחלל החזה.
4. חותכים פתח קטן בסרעפת כדי לשחרר ואקום. חותכים לאורך הצלע ה -10 וה -12 כדי להסיר את הסרעפת ולקבל גישה חזותית לריאות.
5. השתמש מספריים כירורגיים לחתוך את העור עד קנה הנשימה מעל כלוב הצלעות אבל להשאיר את כלוב הצלעות שלם. יש להפריד את העור מכלוב הצלעות. חשפו את קנה הנשימה על-ידי הסרת רקמת החיבור שמסביב, תוך זהירות שלא לפגוע בקנה הנשימה עצמו (איור 1A).
6. חתכו פתח קטן בקוטר של כ-1 מ"מ בקנה הנשימה החשוף במקביל לטבעות הסחוס, קרוב ככל האפשר לגרון (איור 1B). היזהר לא לחתוך לחלוטין דרך קנה הנשימה.
7. קחו מחט 20G והכניסו בעדינות את המחט 4-5 מ"מ לתוך קנה הנשימה ללא כל כוח נגדי (איור 1D). קצה המחט צריך להיות גלוי דרך קנה הנשימה (איור 1C). השתמש במלקחיים כדי לייצב את המחט בקנה הנשימה. לחלופין, ניתן לקשור תפר סביב קנה הנשימה כדי להחזיק את המחט במקומה.
   הערה: על ידי החדרה עמוקה מדי, הקרינה עלולה להיות בטראומה או רק צד אחד של הריאות עשוי להיות מנופח.
8. ממלאים מזרק עם 400 μl של 37 ° C 2% טמפרטורת התכה נמוכה agarose (נלקח ישירות מאמבט טמפרטורה קבועה). ודא שלוח הדיסקציה עומד ולהחדיר לאט לאט את האגרוז החם דרך המחט לריאות, השתמש ~ 400 μl כדי לנפח את הריאות.
   הערה: שימו לב לריאות מתנפחות בתוך כלוב הצלעות. אין לנפח את הריאה יתר על המידה מכיוון שהיא תיקרע.
9. ברגע שהריאות מנופחות, ממלאים ~ 2/3 מכלוב הצלעות, מנתקים את המזרק ושומרים את המחט בתוך קנה הנשימה כדי למנוע דליפת אגרוז.
10. שפכו כ-50 מ"ל של PBS בטמפרטורה של 20°C על הריאות המנופחות כדי לאפשר לאגרוז שבתוך הריאות להתייצב ולהתמצק. הסר לאט את המחט וסגור את קנה הנשימה עם מלקחיים כדי למנוע דליפה של אגרוז לא מוצק.
11. לחשוף את הריאות על ידי ביצוע sternotomy ולאחר מכן הבלו את הריאות. לכריתה של הריאות, להחזיק את קנה הנשימה תוך חיתוך דרך קנה הנשימה לחלוטין. משכו בעדינות את קנה הנשימה כלפי מעלה, חתכו את רקמת החיבור ואת הוושט תוך משיכת הריאות אל מחוץ לחלל החזה עד שהריאות יופרדו מהעכבר (איור 1E).
12. טבלו את הריאות בסל"ד חם-1640 כדי לשטוף דם מופרז והפרידו בעדינות את האונות באמצעות מספריים ומלקחיים כדי לחתוך את ברונכוס הגבעול הראשי של האונות בהילום (איור 1F).
13. מקמו את האונות, כשהמשטח השטוח כלפי מטה כדי למקסם את משטח ההדמיה, בתוך באר של לוח הדמיה של 24 בארות (איור 1G). הוסף 100 μl של 37 ° C RPMI-1640 על גבי אונות. הניחו מספר שקופיות כיסוי מיקרוסקופ עגולות בקוטר 15 מ"מ על גבי האונות כדי למנוע מהן לצוף.
14. שפכו PBS חם לתוך הבארות שמסביב כדי למנוע את המדיה RPMI-1640 מלהתאדות. הכנס את צלחת 24 הבארות לתוך תא האקלים שיווי משקל ולשמור על אונות הריאה ב 37 ° C עם אוויר ו 5% CO₂. הכנס את תא האקלים על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי.
    הערה: ניתן לשקול גם תערובות גזים אחרות (למשל, 5% O₂, 5% CO₂ ב-N₂ כדי לבחון את התנהגות התאים בתנאים של היפוקסיה/חמצן נמוך יותר).

תוצאות

איור 1. פרוטוקול להכנת ריאות להדמיה חיה.(A) חשיפת קנה הנשימה לאחר הכנת העכבר. (B) חיתוך קטן שנעשה בקנה הנשימה החשוף במקביל לטבעות הסחוס. (C) מחט 20 גרם המוחדרת 4-5 מ"מ לקנה הנשימה. (D) החדרה של 400 μליטר 2% טמפרטורת התכה נמוכה לריאות. (E) ריאות מנופחות המופרדות מהעכבר. (F) האו...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הרדמה	נה	נה	הרדמה מאושרת על ידי IACUC, משמשת להרדמה ו / או המתת חסד
PBS, USP סטרילי	Amresco INC	K813-500ML	ציון טהור במיוחד להזרקת i.v.
1X PBS	מתקן תרבית תאים UCSF	נה
פלטפורמת קלקר	נה	נה	ישמש כלוח נתיחה
מספריים עדינים חדים	כלים מדעיים משובחים	14060-11
20 G x 1 מחט, שיקוע קצר	ב.ד.	305178
מלקחיים	חנות כירורגית רובוז	RS-5135
1 מ"ל מזרק ללא מחט	ב.ד.	309659
אגרוז בטמפרטורת התכה נמוכה	לונזה	50111	כדי להפוך 10 מ"ל של פתרון, לשקול 0.2 גרם של agarose, להוסיף 10 מ"ל 1 x PBS, וחום להתמוסס. האגרוז יתמצק בטמפרטורת החדר, לכן יש לשמור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש בניפוח.
RPMI-1640 בינוני ללא פנול אדום	לייף טכנולוגיות	11835-030
24 באר צלחת הדמיה	E&K מדעי	EK-42892
מגלשות כיסוי זכוכית, 15 מ"מ	פישר סיינטיפיק	22-031-144
CO2 דיגיטלי ובקר טמפרטורה	אוקולאב	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
תא אקלים	אוקולאב	נה	http://www.oko-lab.com
Cell Observer דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי	זיס	נה
אוויר	UCSF	נה
חמצן	UCSF	נה
פחמן דו חמצני	UCSF	נה