בדיקת מיצוי RNA: שיטה לחילוץ RNA מתאי סרטן ריאה נגועים miRNA

תקציר

מקור: Hossian, A. K. M. N. et al., אנליזה של טיפולי miRNA קומבינטוריים לוויסות מחזור התא ואנגיוגנזה. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את פרוטוקול מיצוי ה-RNA מתאי סרטן ריאה נגועים ב-miRNA. גישה זו יכולה לשמש לזיהוי פעילות טיפול miRNA קומבינטורית בעצירת מחזור התא ואנגיוגנזה.

פרוטוקול

1. miR-143 ו- miR-506 transfection

זהירות: יש להשתמש בכפפות לטקס, משקפי מגן וחלוק מעבדה בעת ביצוע הניסויים המתוארים. במידת הצורך, השתמש בארון הבטיחות הביולוגית עם מאוורר הארון, מבלי לחסום את דרכי הנשימה או להפריע לזרימת האוויר הלמינרית. כוונו תמיד את חלון הזכוכית המגן לגובה המתאים, כמתואר על ידי היצרן.

1. זרע תאי NSCLC A549 בצלחת באר T25 ס"מ² צלוחיות / 6/96 במדיה DMEM / F12K בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (מדיה תרבית) במכסה מנוע תרבית רקמה ולדגור לילה ב 37 ° C עם 5% CO₂ באינקובטור תרבית רקמה.
2. השהה את miR-143 ו/או miR-506 חיקוי, או ערבל siRNA עם חומר מדביק (2.4 מיקרוגרם של miR עורבבו עם 14 מיקרוליטר של חומר מדביק; ראה טבלת חומרים) ב-500 μL של אמצעי טרנספקציה ו-1.5 מ"ל של מדיית DMEM/F12K ללא נסיוב ואנטיביוטיקה בריכוז miRNA סופי של 100 ננומטר. כמות miRNA עשויה לדרוש אופטימיזציה על תאים וריכוזים שונים. גישות מתאימות כוללות טרנספקציה של תאים עם ריכוזים הולכים וגדלים של miRNA (כלומר, 50-200 ננומטר) והערכה של ביטוי downregulation של הגנים המעניינים.
3. מוציאים את אמצעי התרבית מהצלוחית/צלחת ושוטפים פעם אחת עם PBS אחד.
4. הוסף קומפלקסים של miRNA/חומרים מדביקים ודגירה בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 למשך 6 שעות (גודל הבקבוק מגדיר את נפח הדגירה הנוסף).
5. החליפו את המדיה ב-4 מ"ל של תרבית ודגרו על תאים למשך 24 שעות ו/או 48 שעות.
6. קצור תאים נגועים על ידי טריפסיניזציה, על ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA בכל T25 ס"מ² צלוחיות, לדגור במשך 5-10 דקות ב 37 ° C, ולהוסיף 3 מ"ל של מדיה תרבית כדי לקצור את התאים. מניחים את התוכן של כל בקבוק לתוך צינור נפרד, מסומן 15 מ"ל. עבודה בתרבית רקמות.
7. צנטריפוגה ב 751 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
   הערה: זהירות נדרשת במהלך הסרת supernatant, כמו תסיסה של הצינור עלול לגרום לאובדן תאים.
8. הוסף 2 מ"ל של 1x PBS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 751 x גרם.
9. חזור על שלבים 7 ו- 8 פעם אחת כדי להסיר עקבות של מדיה ו- supernatant.
   הערה: בשלב זה, צינורות מדגם ניתן לאחסן ב -80 ° C או ניתן להשתמש באופן מיידי.

2. מיצוי RNA

1. נקו את אזור העבודה על ידי ריסוס בתמיסת טיהור 70% איזופרופיל אלכוהול ו-RNAse.
2. מיצוי RNA צריך להתבצע באמצעות ערכת RNA מתאימה (ראה טבלת חומרים).
3. הסר את הצינורות מ -80 ° C ולאפשר להם להפשיר. הוסף 300 μL של חיץ ליזיס פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את קרום התא.
4. הוסף נפח שווה של 100% אתנול טהור במיוחד.
5. מערבבים היטב ומניחים בטור הפרדה.
6. צנטריפוגה בין 11 ל 16 x גרם במשך 30 שניות ולהסיר את הזרימה.
7. הוסף 400 μL של חיץ כביסה וצנטריפוגה כדי להסיר את החיץ.
8. הוסף 5 μL של DNAse I עם 75 μL של מאגר עיכול DNA בכל דגימה ודגור במשך 15 דקות.
9. לשטוף את הדגימה עם 400 μL של RNA prep buffer.
10. יש לשטוף פעמיים עם מאגר שטיפת RNA.
11. הוסיפו מים נטולי נוקלאז לעמודה, לצנטריפוגה, ואז אספו את הרנ"א.
12. מדוד את ריכוז הרנ"א הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר UV.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
A549 תאי סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים	ATCC	ATCC CCL-185
Ambion Silencer שליטה שלילית מס '1 siRNA	אמביון	AM4611
חיקוי miRNA has-miR-143-3p	א.ב.מ	MCH01315
חיקוי miRNA has-miR-506-3p	א.ב.מ	MCH02824
סרום בקר עוברי (FBS)	פישר סיינטיפיק	10438026
HyClone פוספט חוצץ מלוחים (PBS)	פישר סיינטיפיק	SH30256FS
DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, ללא נתרן פירובט, עם L-גלוטמין	VWR	VWRL0100-0500
Invitrogen UltraPure DNase/ RNase ללא מים מזוקקים	Invitrogen	10-977-015
ערכות RNA מהיר	מחקר זימו	₪255
אתנול, מוחלט (200 הוכחה), כיתה ביולוגיה מולקולרית,	פישר ביוריאגנטים	BP2818500
-80°C מקפיא	VWR	VWR40086A
ננודרופ	תרמו סיינטיפיק	NanoDrop C אחד
96 צלחת באר	CELLTREAT סיינטיפיק	50-607-511
פניצילין-סטרפטומיצין 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
אינקובטור CO2	תרמו סיינטיפיק	HERAcell 150i
דנאז	מחקר זימו	E1010
תערובת תזונתית F-12K (Kaighn's Mod.) עם L-גלוטמין, קורנינג	קורנינג	45000-354
סרום בקר עוברי - פרימיום	Antlanta Biologicals	S11150
מאצ'ין צנטריפוגות מבוקרות טמפרטורה	תרמו סיינטיפיק	ST16R
מיקרו צנטריפוגות מאצ'ין מבוקרות טמפרטורה	אפנדרוף	5415R