ניתוח מחזור התא: גישה לחקר ויסות מחזור התא של תאי סרטן ריאה נגועים ב- miRNA

תקציר

מקור: Hossian, A. K. M. N., et al. אנליזה של טיפולי miRNA קומבינטוריים לוויסות מחזור התא ואנגיוגנזה.J. Vis. Exp.(2019).

miRNA או microRNA הם מווסתי מפתח של התקדמות מחזור התא. סרטון זה מתאר ניתוח מחזור תאים מבוסס ציטומטריה של זרימה של תאי סרטן ריאות הנגועים ב-miRNA, כדי לחקור את ההשפעה של miRNA על ויסות מחזור התא. עיכוב התרבות על ידי עצירת התקדמות מחזור התא הראה פוטנציאל להיות גישה מבטיחה לטיפול בסרטן.

פרוטוקול

1. miR-143 ו- miR-506 transfection

זהירות: יש להשתמש בכפפות לטקס, משקפי מגן וחלוק מעבדה בעת ביצוע הניסויים המתוארים. במידת הצורך, השתמש בארון הבטיחות הביולוגית עם מאוורר הארון, מבלי לחסום את דרכי הנשימה או להפריע לזרימת האוויר הלמינרית. כוונו תמיד את חלון הזכוכית המגן לגובה המתאים, כמתואר על ידי היצרן.

1. זרע תאי NSCLC A549 בצלחת באר T25 ס"מ² צלוחיות / 6/96 במדיה DMEM / F12K בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (מדיה תרבית) במכסה מנוע תרבית רקמה ולדגור לילה ב 37 ° C עם 5% CO₂ באינקובטור תרבית רקמה.
2. השהה את miR-143 ו/או miR-506 חיקוי, או ערבל siRNA עם חומר מדביק (2.4 מיקרוגרם של miR עורבבו עם 14 מיקרוליטר של חומר מדביק; ראה טבלת חומרים) ב-500 μL של אמצעי טרנספקציה ו-1.5 מ"ל של מדיית DMEM/F12K ללא נסיוב ואנטיביוטיקה בריכוז miRNA סופי של 100 ננומטר. כמות miRNA עשויה לדרוש אופטימיזציה על תאים וריכוזים שונים. גישות מתאימות כוללות טרנספקציה של תאים עם ריכוזים הולכים וגדלים של miRNA (כלומר, 50-200 ננומטר) והערכה של ביטוי downregulation של הגנים המעניינים.
3. מוציאים את אמצעי התרבית מהצלוחית/צלחת ושוטפים פעם אחת עם PBS אחד.
4. הוסף קומפלקסים של miRNA/חומרים מדביקים ודגירה בטמפרטורה של 37°C עם 5%_CO2 למשך 6 שעות (גודל הבקבוק מגדיר את נפח הדגירה הנוסף).
5. החליפו את המדיה ב-4 מ"ל של תרבית ודגרו על תאים למשך 24 שעות ו/או 48 שעות.
6. קצור תאים נגועים על ידי טריפסיניזציה, על ידי הוספת 1 מ"ל של טריפסין-EDTA בכל T25 ס"מ² צלוחיות, לדגור במשך 5-10 דקות ב 37 ° C, ולהוסיף 3 מ"ל של מדיה תרבית כדי לקצור את התאים. מניחים את התוכן של כל בקבוק לתוך צינור נפרד, מסומן 15 מ"ל. עבודה בתרבית רקמות.
7. צנטריפוגה ב 751 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
   הערה: זהירות נדרשת במהלך הסרת supernatant, כמו תסיסה של הצינור עלול לגרום לאובדן תאים.
8. הוסף 2 מ"ל של 1x PBS וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 751 x גרם.
9. חזור על שלבים 7 ו- 8 פעם אחת כדי להסיר עקבות של מדיה ו- supernatant.
   הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן צינורות דגימה ב -80 °C או שניתן להשתמש בהם באופן מיידי.

2. ניתוח מחזור התא

1. זרעו 5 x 10⁵ תאים לכל דגימה בבקבוק^T25 ס"מ 2 ובצעו טרנספקציה בהתאם לפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
2. לאחר 24 שעות ו 48 שעות, ואז לקצור את התאים על ידי טריפסיניזציה.
3. מעבירים את מתלי התא לצינורות סטריליים של 15 מ"ל ומתייגים אותם כראוי.
4. דגימות צנטריפוגות ב 751 x גרם במשך 5 דקות ומשליך את supernatant.
5. הוסף 2 מ"ל של 1x PBS קר כקרח, מערבולת וצנטריפוגה ב 751 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
6. חזור על שלב הכביסה עם 1x PBS כדי להסיר שאריות מדיה.
7. להשהות ולשבור את הגלולה על ידי הוספת 200 μL של 1x PBS קר כקרח על ידי pipetting.
8. תקן את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של אתנול קר כקרח 70% טיפה לצינור תוך ערבול עדין.
9. לדגור צינורות במשך 30 דקות ב RT ולמקם את הצינורות על 4 ° C במשך 1 שעה.
10. הסר צינורות מ 4 ° C וצנטריפוגה ב 751 x גרם למשך 5 דקות.
11. הוסף 2 מ"ל של 1x PBS קר כקרח, מערבולת וצנטריפוגה ב 751 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנטנט.
12. הוסף 500 μL של 1x PBS עם יודיד פרופידיום (50 מיקרוגרם / מ"ל) וריבונוקלאז A (200 מיקרוגרם / מ"ל).
13. יש לדגור במשך 30 דקות ב-RT תוך הגנה על הדגימות מפני אור.
14. קבל נתונים על ציטומטר זרימה. השתמש בפיזור קדימה לעומת צד (FSC לעומת SSC) כדי לבחור את אוכלוסיית התאים העיקרית, למעט פסולת בפינה השמאלית התחתונה של תרשים צפיפות FSC לעומת SSC ואשכולות תאים בחלק העליון עד הימני העליון של תרשים צפיפות FSC לעומת SSC.
15. ניתוח נתונים לזיהוי אוכלוסיות תאים לכל שלב מחזור התא באמצעות תוכנה מתאימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM 4.5 גרם/ליטר גלוקוז, ללא נתרן פירובט, עם L-גלוטמין	VWR	VWRL0100-0500
סרום בקר עוברי - פרימיום	Antlanta Biologicals	S11150
סרום בקר עוברי (FBS)	פישר סיינטיפיק	10438026
פניצילין-סטרפטומיצין 10/10	Antlanta Biologicals	B21210
ריבונוקלאז A מלבלב בקר	סיגמא	₪16513-50 מ"ג
פרופידיום יודיד	MP ביוכימיקלים LLC	IC19545825
אתנול, מוחלט (200 הוכחות), כיתה ביולוגיה מולקולרית	פישר ביוריאגנטים	BP2818500
אינקובטור CO2	תרמו סיינטיפיק	HERAcell 150i
A549 תאי סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים	ATCC	ATCC CCL-185
96 צלחת באר	CELLTREAT סיינטיפיק	50-607-511
FACS Calibur Flowcytometer	בקטון דיקינסון
תרבית תאים BioLite תרבית תרבית טיפול תרומתית	תרמו סיינטיפיק	12-556-009
מאצ'ין צנטריפוגות מבוקרות טמפרטורה	תרמו סיינטיפיק	ST16R
מיקרו צנטריפוגות מאצ'ין מבוקרות טמפרטורה	אפנדרוף	5415R
צינורות צנטריפוגות SpectraTube 15ml	VWR	470224-998
Modfit LT	תוכנת Verity		שלב 2.15: תוכנה חלופית לניתוח התפלגות אוכלוסיית מחזור התא
צינורות מיקרוצנטריפוגות Fisherbrand Basix עם כובעי הצמדה סטנדרטיים	פישרברנד בסיקס	02-682-002
חיקוי miRNA has-miR-143-3p	א.ב.מ	MCH01315
חיקוי miRNA has-miR-506-3p	א.ב.מ	MCH02824
תערובת תזונתית F-12K (Kaighn's Mod.) עם L-גלוטמין	קורנינג	קורנינג 45000-354
מקפיא שלילי 80°C	VWR	VWR40086A