$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. miR-143 ו- miR-506 transfection
זהירות: יש להשתמש בכפפות לטקס, משקפי מגן וחלוק מעבדה בעת ביצוע הניסויים המתוארים. במידת הצורך, השתמש בארון הבטיחות הביולוגית עם מאוורר הארון, מבלי לחסום את דרכי הנשימה או להפריע לזרימת האוויר הלמינרית. כוונו תמיד את חלון הזכוכית המגן לגובה המתאים, כמתואר על ידי היצרן.
- זרע תאי NSCLC A549 בצלחת באר T25 ס"מ2 צלוחיות / 6/96 במדיה DMEM / F12K בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין (מדיה תרבית) במכסה מנוע תרבית רקמה ולדגור לילה ב 37 ° C עם 5% CO2 באינקובטור תרבית רקמה.
- השהה את miR-143 ו/או miR-506 חיקוי, או ערבל siRNA עם חומר מדביק (2.4 מיקרוגרם של miR עורבבו עם 14 מיקרוליטר של חומר מדביק; ראה טבלת חומרים) ב-500 μL של אמצעי טרנספקציה ו-1.5 מ"ל של מדיית DMEM/F12K ללא נסיוב ואנטיביוטיקה בריכוז miRNA סופי של 100 ננומטר. כמות miRNA עשויה לדרוש אופטימיזציה על תאים וריכוזים שונים. גישות מתאימות כוללות טרנספקציה של תאים עם ריכוזים הולכים וגדלים של miRNA (כלומר, 50-200 ננומטר) והערכה של ביטוי downregulation של הגנים המעניינים.
- מוציאים את אמצעי התרבית מהצלוחית/צלחת ושוטפים פעם אחת עם PBS אחד.
- הוסף קומפלקסים של miRNA/חומרים מדביקים ודגירה בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך 6 שעות (גודל הבקבוק מגדיר את נפח הדגירה הנוסף).
- החליפו את המדיה ב-4 מ"ל של תרבית ודגרו על תאים למשך 24 שעות ו/או 48 שעות.
2. ביטוי חלבונים על ידי מיקרו-מערך מחזור תאי נוגדנים
- זרע 5 x 105 תאים לכל דגימה ב T25 ס"מ2 צלוחיות ולבצע טרנספקציה על פי הפרוטוקול המתואר בסעיף 1, שלבים 1-5.
- לאחר 24 שעות ו 48 שעות, לקצור תאים על ידי טריפסיניזציה.
- העבירו את מתלי התאים לצינורות של 15 מ"ל ותייגו אותם בהתאם.
- צנטריפוגה ב 751 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
- הוסף 2 מ"ל של 1x PBS קר כקרח, מערבולת וצנטריפוגה ב 751 x גרם למשך 5 דקות. להשליך את supernatant.
- חזור על שלב הכביסה עם 1x PBS.
- הוסף 150 μL של חיץ ליזיס בתוספת מעכבי פרוטאזות. טפחו מעלה ומטה בעדינות כדי לשבש את קרום התא.
- כדי למנוע הפרעות למאגר הליזיס, בצע החלפת מאגר כדי להחליף את מאגר הליזיס במאגר התוויה, באמצעות עמודות החלפת הממסים של היצרן.
- כמת את החלבון הכולל באמצעות בדיקת BCA.
- קח 70 מיקרוגרם של דגימת חלבון והוסף חיץ תיוג כדי להשיג נפח סופי של 75 μL.
- הוסף 100 מיקרוליטר של דימתילפורממיד (DMF) ל-1 מ"ג של מגיב ביוטין (ביוטין/DMF).
- יש להוסיף 3 μL של ביוטין/DMF לכל דגימת חלבון (דגימת חלבון ביוטינילציה) ולדגור במשך שעתיים ב-RT.
- מוסיפים 35 μL של מגיב עצירה ומערבבים על ידי מערבולת.
- דגרו דגימות ב-RT למשך 30 דקות.
- הסר את שקופיות microarray מהמקרר כך שהם יתחממו ל- RT למשך שעה אחת לפני השימוש.
- בצע חסימה לקשירה לא ספציפית על ידי דגירה על המגלשות בתמיסת חלב יבש 3% (במגיב חוסם שסופק על ידי היצרן) בצלחת פטרי עם ניעור מתמשך במשך 45 דקות ב- RT.
- שטפו את המגלשות במים מסוג ddH2O (אלא אם כן צוין אחרת, הכביסה מתבצעת עם ddH2O).
- חזור על שלב הכביסה ~ 10x כדי להסיר לחלוטין את פתרון החסימה ממשטחי המגלשה. זה חשוב כדי להשיג רקע אחיד ונמוך.
- הסר מים מיותרים ממשטחי המגלשה והמשך לשלב הבא מבלי לתת לשקופיות להתייבש.
- הכינו תמיסת צימוד על ידי המסת חלב יבש 3% בריאגנט צימוד.
- הוסף 6 מ"ל של תמיסת הצימוד ולכמות המלאה של דגימת החלבון ביוטינילציה שהוכנה בעבר משלב 12.
- הניחו שקופית אחת בבאר אחת של תא הצימוד שסופקה על ידי הספק והוסיפו לה ~ 6 מ"ל של תערובת צימוד חלבונים.
הערה: ודא שהשקופית שקועה לחלוטין בתמיסת תערובת צימוד חלבונים.
- מכסים את תא הצימוד ודגרים במשך שעתיים ב-RT עם תסיסה מתמשכת בשייקר מסלולי.
- מעבירים את המגלשות לצלחת פטרי ומוסיפים 30 מ"ל של חיץ כביסה אחד. מניחים את צלחת הפטרי בשייקר מסלולי, מנערים במשך 10 דקות ומשליכים את התמיסה.
- חזור על שלב 24 2x.
- שטפו את המגלשות במים מסוג ddH2O באופן נרחב כמתואר בשלבים 17 ו-18 והמשיכו לשלב הבא באופן מיידי כדי למנוע ייבוש.
- הוסף 30 μL של Cy3-streptavidin (0.5 מ"ג / מ"ל) ב 30 מ"ל של מאגר זיהוי.
- מניחים את המגלשה בצלחת פטרי ומוסיפים 30 מ"ל של חיץ זיהוי המכיל Cy3-streptavidin.
- יש לדגור בשייקר אורביטלי למשך 20 דקות עם רעידות רציפות המוגנות מפני אור.
הערה: Cy-3 הוא צבע פלואורסצנטי. יש לכסות ברדיד אלומיניום או לפעול בתנאים חשוכים כדי לשמור על עוצמת הפלואורסצנטיות.
- בצע את שלבים 24-26 ואפשר למגלשה להתייבש באמצעות זרם עדין של אוויר או הנחת המגלשה בצינור חרוטי 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 1300 x גרם למשך 5-10 דקות.
- הניחו את המגלשה במחזיק שקופיות וכסו ברדיד אלומיניום.
- סרוק את השקופית בסורק microarray עם אורכי גל העירור והפליטה המתאימים. במקרה של Cy3, שיא אורך גל העירור הוא ב~550 ננומטר ושיא הפליטה ב~570 ננומטר.
- נתח את הנתונים (ראה טבלת חומרים עבור התוכנה שבה נעשה שימוש).