הכנת ריאות עכבר לציטומטריית זרימה: יצירת תרחיף תאים מרקמת הריאה לאנליזה ציטומטרית של זרימה

תקציר

מקור: Moll, H. P., et al. השתלה אורתוטופית של תאי אדנוקרצינומה סינגניים של ריאות לחקר ביטוי PD-L1. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הכנת תרחיף תאי הריאה של עכבר לניתוח ציטומטרי זרימה לחקר ביטוי PD-L1 של תאי אדנוקרצינומה ריאתיים.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת ריאות לציטומטריית זרימה

1. בנקודת הסיום הניסיונית הרצויה, הרגיעו את העכבר על ידי הזרקה תת עורית של תערובת קטמין (100 מ"ג / ק"ג משקל גוף) וקסילזין (10 מ"ג / ק"ג משקל גוף) והרדימו אותו על ידי נקע צוואר הרחם.
2. השרו את הפגר באתנול 70% והדקו את העכבר על לוח דיסקציה באמצעות סרט הדבקה.
3. בצעו חתך בקו האמצע הגחוני והפכו בעדינות את העור כדי לחשוף את שרירי דופן בית החזה ואיברי הבטן. לנקב את הסרעפת לחתוך את הצלעות עם מספריים כדי לחשוף את חלל החזה.
4. לנקב את הריאות 3x עם 6 - 8 מ"ל של PBS קר כקרח דרך החדר הימני באמצעות מחט 27 G לאחר חיתוך פתח קטן בחדר השמאלי כדי לאפשר לדם לצאת. הריאות צריכות להיות מנוקות מדם ולהפוך לבנות לחלוטין.
5. מוציאים את הריאות וטוחנים את האונות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים. מעבירים את חתיכות הריאה לצינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 2 מ"ל ודגרים עליו ב-1.5 מ"ל של חיץ עיכול ריאות (RPMI, 5% FCS, 150 U/mL collagenase I ו-50 U/mL DNase I).
6. לדגור את חתיכות הריאה 30 - 60 דקות ב 37 ° C עם רעד מתמיד.
7. העבירו את תרחיף תאי הריאה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור של 50 מ"ל. נקה את המסננת עם גב מזרק סטרילי של 10 מ"ל ושטוף את המסננת עם 15 מ"ל של PBS עם 2% FCS.
8. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולשאוף את supernatant. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK) חיץ lysing ולדגור אותם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עבור lysis של אריתרוציטים שיורית.
9. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של PBS עם 2% FCS ולהמשיך עם פרוטוקול צביעה הרצוי עבור ציטומטריה זרימה
   הערה: לחלופין, ניתן להשעות מחדש את התאים בסל"ד המכיל 30% FCS ו-10% DMSO ולהקפיא אותם באמצעות מיכל הקפאה לצורך ניתוח מאוחר יותר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכבר ריאות אדנוקרצינומה קו תאים			מבודד בתוך הבית
C57Bl/6 עכברים			F1 של הצלב של שני הרקעים ניתן להשתמש (8-12 שבועות)
עכברי 129S
סל"ד 1640 בינוני	לייף טכנולוגיות	11544446
סרום עגל עובר	לייף טכנולוגיות	11573397
תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין	לייף טכנולוגיות	11548876
ל-גלוטמין	לייף טכנולוגיות	11539876
קטזול (100 מ"ג/מ"ל קטמין)	אוגריס פארמה	8-00173
קסילסול (20 מ"ג/מ"ל קסילזין)	אוגריס פארמה	8-00178
מלקחיים קהים	רובוז	RS8260
מספריים של איריס הסטודנטית	כלים מדעיים משובחים	91460-11
DNase I (ללא RNase)	מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנד	M0303S
קולגנאז סוג I	לייף טכנולוגיות	17100017
ACK Lysing Buffer	לונזה	10-548E