בדיקת אימונופלואורסנציה: שיטה לזיהוי תאי גידול שנלכדו על חוט רפואי

תקציר

מקור: Gallerani, G. et.al., אפיון תאי גידול באמצעות חוט רפואי ללכידת תאי גידול במחזור: גישה תלת ממדית המבוססת על אימונופלואורסנציה ודגי DNA. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של צביעה אימונופלואורסצנטית של תאי גידול במחזור שנלכדו על חוט רפואי מתפקד. החוט המתפקד מאפשר בידוד של CTCs in vivo, ישירות מזרם הדם של המטופל.

פרוטוקול

1. דג אימונו-DNA על חוט

1. קו סלולרי ספייק-אין על חוט (תמיכה בתלת-ממד)
   הערה: הגדרה ראשונית כוללת בחירה מדויקת של שורות תאים דבקים המבוססות על EpCAM-positivity. החוט מתפקד עם נוגדנים נגד EpCAM כך שרק תאים חיוביים ל- EpCAM מוכתמים.
   הערה: אין לגעת בחלק המתפקד של החוט כדי למנוע נזק.
   הערה: כל השלבים צריכים להתבצע תחת מכסה מנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים.
   1. יש להשהות מחדש את כל תכולת בקבוק T75 (מפגש של 80%) בבקבוקון של 5 מ"ל באמצעות 4 מ"ל של תווך שלם; עבור ספייק בודד, מומלץ לכ-2,000,000 תאים למקסם את היצמדות התאים לחוט.
   2. הסר את החוט מאריזת הזכוכית שלו.
   3. טבלו את חלק הזהב הפונקציונלי של החוט לתוך הבקבוקון, וודאו שפקק החוט מתאים למים לבקבוקון. חותם עם סרט מעבדה.
      הערה: מומלץ להשתמש בצינור 5 מ"ל כדי לאפשר התאמה נכונה בין פקק התיל לבקבוקון.
   4. דגירה במשך 30 דקות ב- RT במסובב צינור (זווית 0-120).
   5. שטפו את החוט שלוש פעמים בתמיסת PBS 1× באמצעות 3 בקבוקונים נקיים שונים.
2. קיבוע וחדירה
   זהירות: אצטון הוא חומר דליק שיכול לגרות את דרכי הנשימה. השתמש רק בפלסטיק עמיד באצטון או במיכלי זכוכית (ללא PVC או PVDF).
   הערה: בצעו את השלבים הבאים מתחת למכסה מנוע של אדים כימיים.
   1. יבשו את החוט באוויר.
   2. תקן את התאים על ידי טבילת החוט בתמיסת אצטון 100% למשך 10 דקות ב- RT. השתמש בצינור 5 מ"ל.
      הערה: אסור שפקק התיל יבוא במגע עם הקיבוע.
   3. יבש את החוט באוויר למשך 5 דקות בכתובת RT.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. החוט חייב להיות מאוחסן ב -20 °C. בעת אריזת החוט לאחסון לטווח ארוך, הניחו את פקק החוט ליד הקצה המתפקד והכניסו בזהירות את החוט לצינור זכוכית האחסון, תוך הקפדה שלא לפגוע בקצה המתפקד. סגור את זכוכית האחסון ואחסן (אנכית או אופקית) ב- -20°C.
3. יום Immunofluorescence 1
   הערה: שלב זה כולל דגירה של לילה (~ 16 שעות).
   1. יש לשטוף פעמיים בתמיסת 1× PBS באמצעות צינור 5 מ"ל.
   2. לדגור על החוט במאגר דילול נוגדנים למשך 30 דקות ב- RT באמצעות צינור 5 מ"ל.
   3. הכן 150 μL של תערובת נוגדנים עם דילול של נוגדן ראשוני חד שבטי מצומד עם פלואורוכרום במאגר דילול נוגדנים, כמפורט בגליון הנתונים. לדוגמה, נוגדן EpCAM-FITC שימש עם דילול 1:20.
   4. השתמש בקצה p200 כדי לבצע דגירה, באופן הבא: חלץ את החוט מפקק החוט והכנס בעדינות את החוט דרך החור הגדול יותר של הקצה. הכנס תחילה את הקצה הלא מתפקד ומשוך את החוט לאט דרך החור הקטן יותר עד שחלק הזהב נמצא ממש מעבר לחור הגדול יותר.
   5. יש לטפטף בעדינות 150 μL של תערובת הנוגדנים (למשל נוגדן אנטי EpCAM_FITC 1:20 מדולל) לתוך הקצה. כדי למנוע את הסיכון של היווצרות בועות, סובב בעדינות את החוט עד החלק המתפקד הוא צלל לחלוטין.
   6. אטמו את חור הקצה. כריכת סרט מעבדה סביב החור יכולה לעזור.
   7. לדגור אנכית לילה (~ 16 שעות) בחושך ב 4 ° C.
4. Immunofluorescence יום 2
   1. חסום דגירה נוגדנים על ידי שטיפת החוט פעמיים ב 1× PBS.
   2. הכנס מחדש את החוט לפקק התיל.
      הערה: יש לאחסן ב-1X PBS בטמפרטורה של 4°C בבקבוקון של 5 מ"ל עד לביצוע בדיקת FISH.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אתנול	קרלו ארבה	# 414605
טווין 20	ביו ראד	# 1706531
PBS (מלח חוצץ פוספט)	מדיקגו	# 09-9400-100
אצטון	סיגמא אולדריץ'	# 534064-500ML
מלט גומי	רויאל טאלנס	# 95306500
EpCAM-FITC (שיבוט: HEA-125)	מיטניי	#130-080-301
RPMI 1640	גיבקו	# 31870-025
XT ALK BA	בדיקות MetaSystems	# D-6001-100-OG
Detektor CANCER01 EpCAM	גילופי ננומדיזין		חוט פונקציונלי
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ZEISS אקסיוסקופ	ZEISS
ניקון NIS-Elements BR 4.11.00 תוכנה 64 סיביות	ניקון
Nikon DS-QiMc 12 סיביות מצלמה דיגיטלית	ניקון	DS-QiMc