מיצוי miRNA: שיטה לחילוץ miRNA מדגימת פלזמה

תקציר

מקור: Mensah, M. et. al., MicroRNA מבוסס ביופסיה נוזלית: החוויה של מסווג חתימה miRNA פלזמה (MSC) עבור הקרנה סרטן ריאות. J. Vis. Exp. (2017).

MicroRNAs (miRNAs) הם RNA ספציפיים לרקמות, קטנים ולא מקודדים המווסתים ביטוי גנים, ויכולים להוות מועמדים אידיאליים לגילוי מוקדם של סרטן ריאות. בפרוטוקול המוצג, נבודד מיקרו-רנ"א מדגימות דם של מטופלים לצורך הקרנה מוקדמת של סרטן ריאות.

פרוטוקול

1. אוסף דגימות פלזמה

1. יש לאסוף 10 מ"ל של דגימת דם שלמה בצינורות Vacutainer עם K₂EDTA מצופה בתרסיס ולאחסן בטמפרטורת החדר.
   הערה: כדי למזער את המוליזה, להפריד פלזמה בתוך 2 שעות. אין לאחסן את כל הדם בטמפרטורה נמוכה (כלומר, 4°C) כדי למנוע הלם תרמי וליזה של תאים שמובילים לשחרור miRNA לא ספציפי.
2. תוך שעה אחת, הפרד את הפלזמה על ידי צעד צנטריפוגה ראשון ב 1,258 x גרם ו 4 ° C במשך 10 דקות.
3. להעביר את supernatant פלזמה לתוך צינור 15 מ"ל, בזהירות הימנעות ממגע עם טבעת הלימפה.
4. צנטריפוגה את הפלזמה בפעם השנייה ב 1,258 x גרם ו 4 ° C במשך 10 דקות.
5. Aliquot 1 מ"ל של פלזמה לתוך 1.5 מ"ל cryovials, הימנעות איסוף חלק פלזמה בבסיס הצינור.
6. לאחסן את כל aliquots ב -80 ° C, למעט אחד להערכת המוליזה. הניתוח המולקולרי צריך להתבצע תוך 5 שבועות.

2. מיצוי RNA כולל פלזמה

1. הכינו תמיסת 1-תיוגליצרול/הומוגניזציה (OMG) עם 20 מיקרוליטר של 1-תיוגליצרול למ"ל של תמיסת הומוגניזציה. מאז 1-Thioglycerol הוא צמיג, בזהירות פיפטה למדידה מדויקת. יש לקרר את תמיסת OMG על קרח או בטמפרטורה של 2-10 מעלות צלזיוס לפני השימוש בה.
   הערה: פתרון העבודה יציב ב 2-10 מעלות צלזיוס במשך חודש אחד.
2. להשהות את DNase I lyophilized על ידי הוספת 275 μL של מים ללא nuclease לתוך בקבוקון בעדינות לערבב (לא מערבולת). כעזר חזותי, הוסף 5 μL של צבע כחול ל- DNase I המשוחזר וחלק את התמיסה לאליציטוטים חד-פעמיים בצינורות נטולי נוקלאז. אחסן DNase I משוחזר ב -30 ° C עד -10 ° C.
3. החל מ 200 μL של פלזמה, להוסיף 200 μL של פתרון OMG מקורר.
4. מערבולת 15-30 שניות כדי להבטיח הומוגניזציה מלאה. אם מתרחש קצף, תן לדגימה להתיישב על קרח.
5. הוסף 200 μL של Lysis Buffer ו- 25 μL של Proteinase K לדגימה הומוגנית ולמערבולת למשך 20 שניות.
6. לדגור את הדגימות במשך 15 דקות thermomixer שחומם מראש ב 37 ° C.
7. טען מחסנית עבור כל דגימה על מגש הסיפון של המכשיר והנח את התקע במיקום הנכון.
8. העבר את הליזט למיקום המתאים במחסנית המכשיר.
9. הוסף 5 μL של תמיסת DNase I למיקום הנכון במחסנית.
10. הוסף 60 μL של מים נטולי nuclease לבסיס של כל צינור elution.
11. בחר את שיטת "רקמת miRNA RSC" והתחל את ריצת הטיהור האוטומטית. ניתן לאחסן את סך דגימות הרנ"א בטמפרטורה של -80°C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1x PBS	לונזה	BE-17-516
מאגר 20xTE, pH 8.0	בדיקה מולקולרית	T11493	דללו את תמיסת מלאי 20X כדי לקבל את הריכוז הסופי של 0.1X במים נטולי Nuclease
מים ללא Nuclease
ערכת רקמות miRNA של Maxwell RSC	פרומגה	AS1460	הערכה מכילה תמיסת הומוגניזציה, DNase I, פרוטאינאז K, חיץ ליזיס ומחסניות. עבור 1-Thioglycerol, שאיפה ומגע עם העור והעיניים יש להימנע. השתמש בו תחת ארון אדים.
Vacutainer בטיחות נעילת דם ערכת איסוף דם	בקטון דיקינסון	367286-364815
מערבול מיקסר	Velp Scientifica	F202A0173
ThermoMixer T- שייקר	יורושיבוט	A00564	הביאו את המיקסר התרמי לטמפרטורה של 37°C לפני תחילת מיצוי ה-RNA
מכשיר Maxwell RSC	פרומגה	AS4500
בקבוקונים קריוגניים 1.5 מ"ל	סיגמא-אולדריץ'	Z359033