צביעה אימונוהיסטוכימית: שיטה לקבלת מידע מרחבי מקטעי רקמה דקה

Abstract

מקור: Baharom F. et al., תאים דנדריטיים של הריאה האנושית: התפלגות מרחבית וזיהוי פנוטיפי בביופסיות אנדוברונכיאליות באמצעות אימונוהיסטוכימיה וציטומטריית זרימה. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מתאר את טכניקת הצביעה האימונוהיסטוכימית לזיהוי תאים דנדריטיים מביופסיות אנדוברונכיאליות.

Protocol

1. חלוקת GMA.

1. הכינו תמיסת אמוניה 0.05% עם מים מזוקקים. מניחים את סכין הזכוכית והביופסיה במיקרוטום. יישרו בזהירות את בלוק הביופסיה עם הלהב על ידי התאמת מחזיק הסכין וזווית גוש הביופסיה כך שהלהב יונח שטוח על פני השטח של הבלוק.
2. חתכו מקטעים בעובי 2 מיקרומטר באמצעות המיקרוטום במהירות חיתוך איטית והשתמשו במלקחיים כדי להעביר ולצוף החוצה חלקים על מי האמוניה. הציפו את המקטעים במשך 45-90 שניות, מה שמאפשר שליפת אנטיגן עדינה ופתיחת הקטע.
3. להרים מקטעים עם שקופית מיקרוסקופ. בדוק את היסטולוגיה ביופסיה על ידי צביעה מהירה עם כחול toluidine.
4. יבשו את המגלשות על פלטה חמה לטמפרטורה של 50°C ומרחו 500 μl של כתם כחול טולוידין מסונן על חלק באמצעות פיפטת פסטר מפלסטיק. מחממים את החלק שעל הפלטה החמה עד שטבעת ירוקה מתחילה לצאת בקצה הכתם, ואז שוטפים אותה במים.
5. באמצעות מיקרוסקופ אור, לבדוק את היסטולוגיה ביופסיה. חלקים המשמשים לאימונוהיסטוכימיה צריכים להכיל אזורים טובים של למינה פרופריה ואפיתל שלא ניזוקו, עם כמה שפחות בלוטות וכמה שפחות שריר חלק.
6. חתכו חלקים שיש להם היסטולוגיה טובה והרימו אותם עם שקופיות מיקרוסקופ מצופה פולי L-ליזין (מצופה PLL) לצביעה אימונוהיסטוכימית. יש לחתוך לפחות שני חלקים מכל ביופסיה לצורך ניתוח. מגלשות יבשות למשך שעה אחת לפחות. לאחר הייבוש, חלקים ניתן לעטוף בנייר כסף ולאחסן ב -20 ° C עד 2 שבועות, או שהם יכולים להיות immunostained מיד.

2. צביעה אימונוהיסטוכימית של ביופסיות אנדוברונכיאליות משובצות GMA

הערה: נתרן אזיד הוא רעיל. הכינו את תמיסת הנתרן אזיד 0.1% בתוך מכסה אדים והרחק מחומצות. מגע עם חומצות משחרר גזים רעילים.

1. צייר מסביב למקטעים באמצעות עט עם קצוות יהלום וסדר את השקופיות על מדף צביעה.
2. בצע בלוק Peroxidase. הכינו תמיסת בלוק פרוקסידז של 0.3% מי חמצן בתמיסת נתרן אזיד 0.1%. החל 1 מ"ל של בלוק peroxidase על חלקים לדגור במשך 30 דקות.
3. הכינו תמיסת שטיפה של 0.05 M Tris-buffered מלוחים (TBS), pH 7.6. שטפו את המגלשות ב-TBS, 3x5 דקות.
4. הכן פתרון בלוק BSA 1% ב- DMEM. לעשות את זה מראש ובכמויות גדולות, aliquot ולהקפיא אותו עד הצורך. מסננים את המגלשות ודגרים על המקטעים בתמיסת בלוקים למשך 30 דקות כדי לחסום קשירת נוגדנים לא ספציפית. אם עדיין מתרחשת קשירה לא ספציפית, כלול שלב דגירה של 30 דקות עם בלוק של 5% בסרום מאותו המין כמו הנוגדן המשני.
5. לדלל נוגדן ראשוני (CD45 או CD1a) ב-TBS לריכוז הרצוי (CD45 מדולל בקנ"מ 1:1,000; CD1a מדולל ביחס של 1:1,00) ולהחיל אותו על שקופיות. מכסים את המקטעים ודגרים לילה ב-RT.
6. שטפו שקופיות ב-TBS שלוש פעמים. לדלל נוגדן משני biotinylated (מכוון נגד המין המארח נוגדן ראשוני, במקרה זה ארנב נגד עכבר F(ab'₂)) ב TBS לריכוז הרצוי (דילול 1:300) ולהחיל אותו על שקופיות. לדגור במשך שעתיים ב- RT.
7. הכינו קומפלקס סטרפטאבידין ביוטין-פרוקסידאז לפחות 30 דקות לפני השימוש. ודא שיש מספיק כדי לכסות את כל המגלשות. שטפו את המגלשות ב-TBS שלוש פעמים. החל את הפתרון על המגלשות ודגר במשך שעתיים ב- RT.
8. שטפו את המגלשות ב-TBS שלוש פעמים. הכן 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) תמיסת מצע peroxidase (מיוצר לפי הוראות היצרן). יש למרוח אותו על המגלשות ולדגור במשך 20-30 דקות או עד להתפתחות עוצמת הכתם הרצויה.
9. שטפו את המגלשות במי ברז זורמים במשך 5 דקות. הכתימו את המקטעים בתמיסת המטוקסילין מסוננת של מאייר למשך 2 דקות. שטפו את המגלשות במי ברז זורמים למשך 5 דקות.
10. מסננים את המגלשות ומכסים את החלקים באמצעי הרכבה מימי קבוע. יבשו את המגלשות ב-80°C בתנור ייבוש. אפשר לשקופיות להתקרר, ולאחר מכן הרכיב אותן עם DPX והנח תלוש כיסוי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
חתך GMA
שקופיות מיקרוסקופ זכוכית	תרמופישר סיינטיפיק	10143562CEF	קצוות חתוכים, קצה חלבי
תמיסת פולי-ל-ליזין	סיגמא-אולדריץ'	P8920-500 מ"ל	1:10 לפתרון עבודה
רצועות זכוכית לאולטרה-מיקרוטומיה	אלקר
טווין 20	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 2287	תמיסת כביסה (0.1% טווין20)
יצרן סכינים LKB 7800B	ל.ק.ב
מפצל קפסולה	מעבדות TAAB	C065
פלדת פחמן להבים בעלי קצה יחיד	מעבדות TAAB	B054
סגן
אמוניה, 25%	VWR	1133.1	2 מ"ל ב 1 L, 1:500 (0.05%)
מיקרוטום	לייקה		לייקה RM 2165
מקור אור	לייקה		Leica CLS 150 XE
מיקרוסקופ עם מעמד זרוע נדנדה	לייקה		Leica MZ6
GMA אימונוהיסטוכימיה
עט עם קצוות יהלומים	היסטולאב	5218
תמיסת מי חמצן 30%	אנאלה נורמפור	23619.264
נתרן אזיד	סיגמא-אולדריץ'	S8032
טריס	רוש	10708976001
נתרן כלורי	כימיקלים של VWR	27810.295
אלבומין בסרום בקר	מיליפור	82-045-2	ציון אבחון BSA של Probumin
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)	סיגמא-אולדריץ'	D5546
נוגדן CD45 אנטי אנושי	ביולג'נד	304002	עכבר חד שבטי, שיבוט HI30, איזוטיפ IgG1k. ריכוז עבודה של 500 נ"ג/מ"ל
נוגדן CD1a אנטי אנושי AbD	סרוטק	MCA80GA	עכבר חד שבטי, שיבוט NA1/34- HLK, איזוטיפ IgG2a. ריכוז עבודה של 10 מיקרוגרם/מ"ל
עכבר חד-שבטי IgG1 איזוטיפ לשלוט	אבקאם	ab27479
עכבר חד-שבטי IgG2a איזוטיפ לשלוט	דקו	X094301-2
ערכה סטנדרטית Vectastain ABC Elite	מעבדות וקטוריות	PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) עפיפון מצע פרוקסידז	מעבדות וקטוריות	SK-4200
מאיירס המטוקסילין	HistoLab	1820
הרכבה מימית קבועה בינוני	עבד סרוטק	BUF058C
תנור ייבוש
פתרון הרכבה קבוע DPX	VWR	360292F
מיקרוסקופ אור	לייקה		Leica DMLB
מצלמת מיקרוסקופ	לייקה		לייקה DFC 320
תוכנת ניתוח	לייקה		Leica Qwin V3