בידוד אקסוזום: טכניקה להפרדת אקסוזומים מהפלזמה של חולי סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים

תקציר

מקור: Giallombardo, M., et al. ניתוח miRNA אקסוזומלי בפלזמה של חולי סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) באמצעות qPCR: כלי אפשרי לביופסיה נוזלית. J. Vis. Exp.(2016).

האקסוזומים המבודדים בפלזמה יכולים לשמש כדרך לא פולשנית וחוזרת על עצמה לגילוי ומעקב אחר הסמנים הביולוגיים לגילוי מוקדם והתקדמות המחלה. סרטון זה מתאר את הפרוטוקול להפרדת אקסוזומים מדגימות פלזמה של חולי סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים, אשר יכול לשמש למיצוי DNA וחלבונים.

פרוטוקול

1. בידוד אקסוזום

הערה: בידוד האקסוזומים מדגימות פלזמה, בוצע באמצעות ערכה מסחרית, על פי פרוטוקול היצרן ועל ידי הוספת טיפול RNAse: (כל השלבים הללו חייבים להתבצע עם ציוד מגן אישי וסביבתי ובעקבות הליך משפטי ספציפי למניפולציה של דגימות ביולוגיות).

1. קח 1 מ"ל של פלזמה של כל דגימה, מאוחסן ב -80 ° C, והניח אותו על קרח.
2. צנטריפוגה הדגימה ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב RT; מעבר זה הוא חובה על מנת להסיר תאים ופסולת.
3. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הפלזמה הנקייה לשפופרת חדשה של 1.5 מ"ל.
4. צנטריפוגה את הצינור החדש ב 10,000 × גרם במשך 20 דקות ב RT.
5. מעבירים את הסופרנאטנט המכיל את הפלזמה הנקייה לשפופרת חדשה של 1.5 מ"ל.
6. הוסיפו 100 נ"ג/מ"ל RNAse לסופרנאטנט ודגרו על הצינור בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות על מנת לפרק את הרנ"א במחזור.
7. העבר את כל הפלזמה המטופלת לצינור חדש של 2 מ"ל והוסף נפח 0.5 של PBS 1x.
8. מערבלים את הדגימה על מנת לערבב את התמיסות.
9. הוסף 0.05 כרכים של תמיסת פרוטאינאז K (מצורף לערכה) לדגימה.
10. מערבבים את הדגימה ולאחר מכן דוגרים ב 37 ° C במשך 10 דקות.
11. הוסף 0.2 נפח של מאגר משקעים אקסוזום למדגם וערבב את התמיסות בהיפוך.
12. דגרו על הדגימה בטמפרטורה של 2°C עד 8°C למשך 30 דקות ולאחר מכן בצעו צנטריפוגה של הדגימה בטמפרטורה של 10,000 × גרם למשך 5 דקות ב-RT.
13. שאפו והשליכו את הסופר-נאנט. הגלולה מכילה את האקסוזומים המבודדים.
14. הוסף חיץ שנבחר לגלולת האקזוזום כדי להשהות מחדש את האקסוזומים. בחירת המאגר תלויה בניתוח במורד הזרם המתוכנן, במקרה זה:
    1. הוסף 100 μl של 1x PBS על מנת לבצע ניתוח TEM.
    2. הוסף 346.5 μl של חיץ ליזה ספציפי למיצוי RNA (מתוך ערכה מסחרית) (זהירות: סיכון כימי).
    3. יש להוסיף 100 μl של חיץ ליזה למיצוי חלבונים (Tris-HCl 50 mM pH 7.6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0.5% - PMSF 1 mM - Leupeptin/Aprotinin 10 μg/ml) על מנת לבצע ניתוח Western Blotting. (זהירות: סיכונים כימיים).
15. אחסנו את האקסוזומים המרחפים מחדש בטמפרטורה של -20°C.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת בידוד אקסוזום כוללת (מפלזמה)	Invitrogen	4484450	השתמש בטיפול Proteinase K
ריבונוקלאז A	סיגמא-אולדריץ'	R4875-100MG
ערכת מיני RNAspin Illustra 50	GE HealthCare	25-0500-71