דג DNA תלת-ממדי: טכניקה לאיתור גן מסוים על כרומוזום

תקציר

מקור: Gallerani, G. et.al. אפיון תאי גידול באמצעות חוט רפואי ללכידת תאי גידול במחזור: גישה תלת ממדית המבוססת על אימונופלואורסנציה ודגי DNA. J. Vis. Exp. (2017).

בידוד ואפיון תאי גידול במחזור הדם של חולי סרטן הוא סוג של ביופסיה נוזלית לא פולשנית וקשורה להישנות המחלה ולהתקדמות המחלה. סרטון זה מתאר את הטכניקה של הכלאה פלואורסצנטית באתרו של DNA (DNA FISH) על CTCs שנלכדו על חוט רפואי, כדי לחקור גן ספציפי מעניין.

פרוטוקול

1. 3D DNA-FISH יום 2

זהירות: יש להקדיש תשומת לב מיוחדת לטמפרטורה הגבוהה של המכשירים והחדר הלח.

1. הגדר את תנור ההכלאה ואת תנור החימום היבש (~ 3 שעות לפני תחילת פרוטוקול DNA-FISH). כוונו את תנור ההכלאה ל-75°C, כוונו את תנור החימום היבש ל-37°C וקררו את תמיסת ה-SSC 0.4× (pH = 7.0 ± 0.1) ל-4°C.
   הערה: מצב ה- pH של מאגרי FISH הוא קריטי וחייב להיות 7.0 ± 0.1.
2. לשטוף את החוט 3 פעמים קר כקרח 0.4× SSC solution.
   הערה: שמור את החוט בחושך כדי למנוע הלבנה פלואורוכרום במהלך ההליכים הבאים.
3. יבש במשך 10 דקות בחושך מתחת לארון האדים.
4. מערבלים ומסובבים את הגשושית במשך 5 שניות.
5. זרוק 10 μL של הבדיקה לתוך microtubes זכוכית. מכסים בסרט מעבדה.
6. סובבו את המיקרו-צינוריות באופן הבא: עטפו את המיקרו-צינור בחומר סופג יבש, הכניסו נייר לצינור של 50 מ"ל וסובבו לזמן קצר.
7. מניחים בזהירות את החוט המיובש לתוך המיקרו-צינור ומכניסים את פקק החוט. אטם במלט גומי.
   זהירות: שני השלבים הבאים כרוכים בטמפרטורות גבוהות. יש ללבוש כפפות מגן.
8. הכניסו את החוט לתא כהה ולח בתנור ההכלאה למשך 8 דקות בטמפרטורה של 75°C כדי לקבל דנטורציה מלאה של DNA.
9. מעבירים את התא הלח לתנור חום יבש ב-37°C למשך הלילה.

2. 3D DNA-FISH יום 3

1. הכניסו לאמבט מים צנצנת מכתימה עם תמיסת SSC × 0.4 וקבעו על 72°C.
2. בדוק את טמפרטורת תמיסת SSC של 0.4× עד שהיא מגיעה ל- 72 ± 1 ° C.
3. הכינו שתי כוסות זכוכית, אחת עם 2× SSC + 0.05% טווין (pH = 7.0 ± 0.1) פתרון והשני עם מים מזוקקים.
4. מוציאים את התא הלח מתנור החום היבש, מוציאים בזהירות את מלט הגומי מפקק התיל באמצעות פינצטה, ומוציאים את החוט.
   הערה: משוך בזהירות את הקצה הלא מצופה של החוט דרך ה- IN-Stopper, תוך זהירות שלא לפגוע בקצה המתפקד
.
5. טבלו את החוט בתמיסת SSC × 0.4 למשך 2 דקות בטמפרטורה של 72°C.
6. שטף את החוט בתמיסת 2× SSC + 0.05% Tween למשך 30 שניות ב- RT.
7. שטפו את החוט במים מזוקקים ב-RT.
8. יבש את החוט מתחת למכסה האדים למשך 10 דקות בחושך.
9. הכן תמיסת מלאי DAPI של 1.43 מיקרומטר ב- 2 מ"ל של 1× PBS.
10. דגור על הקצה המתפקד של החוט עם תמיסת DAPI בבקבוקון של 2 מ"ל למשך שעה אחת בחושך ב- RT.
11. יש לשטוף את החוט פעמיים ב-1× PBS ולייבש באוויר.

3. 3D תצפית וניתוח מיקרוסקופ

1. מקם את החוט במחזיק החוט. הכניסו בזהירות את הקצה המתפקד דרך נקודת הכניסה של המחזיק המיוחד, עד שהקצה יתאים לנקודת הצימוד. היזהרו לא לפגוע בקצה המתפקד (איור 1a).
2. הניחו את המחזיק המיוחד על במת המיקרוסקופ. כוונן את מיקוד המיקרוסקופ באמצעות עדשת 20×. תחילה התמקד באופן גס בתמיכה המיוחדת ולאחר מכן התאם בעדינות לתאים שנראים בהירים בערוץ DAPI.

תוצאות

איור 1: חוט פונקציונלי, סידור סכמטי של גשושיות פירוק ALK, סכימת דפוסים צפויים של סידור מחדש של ALK ומחזיק מיוחד.(א) תיבות אדומות מדגישות את שלושת החלקים העיקריים של החוט: קצה פונקציונלי, פקק תיל וקצה לא מתפקד. הקצה הפונקציונלי הוא החלק העדין ביותר של החוט ואין לגעת בו במהלך הטיפול כדי למנוע ניתוק או נזק לתא. (b) הגשושיות הירוקות והאדומות נקשרות כל אח...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
טווין 20	ביו ראד	# 1706531
Vysis 20X SSC (66 גרם)	אבוט מולקולר בע"מ	# 30-804850	אבקה שתרחף מחדש במים מזוקקים, לפי המומלץ
מים	מיליפור
DAPI, כיתה FluoroPure	Invitrogen	# D21490
מיקרוסקופ פלואורסצנטי ZEISS אקסיוסקופ	ZEISS