שימור רקמות משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE): שיטה לחקר מורפולוגיה של רקמות

תקציר

מקור: Nagaraj A.S., et al., הקמה וניתוח של פרוסות גידול כתנאי מוקדם לבדיקות אבחון. J. Vis. Exp. (2018)

הסרטון הבא מתאר כיצד לשמר מורפולוגיה של רקמה באמצעות קיבוע פורמלין והטבעה של פרפין.

פרוטוקול

1. קיבוע ועיבוד פרוסות הרקמה

1. הרימו בזהירות את הפרוסה הלא מתורבתת של 0 שעות או את הפרוסה המתורבת על נייר סינון ספוג ב-PBS.
   1. לשם כך, הוסף 2-3 מ"ל של PBS על גבי נייר סינון המונח בצלחת של 10 ס"מ. הניחו את הפרוסה על גבי נייר הסינון והרימו את נייר הסינון בעזרת זוג מלקחיים.
   2. העבירו את נייר הסינון להיסטוקסטה, והוסיפו טיפה של המטוקסילין מדולל (1:1 במים שעברו דה-יוניזציה) על גבי פרוסת הרקמה כדי לסמן באופן גלוי את מיקום הפרוסה במהלך שלבי העיבוד הבאים (איור 1D).
   3. סוגרים את הקלטת, ומעבירים אותה לתמיסת פורמלין חוצצת ניטרלית 4%. תקן את הרקמות לילה ב 4 °C.
      הערה: בשעת הנחת הפרוסה על גבי נייר הסינון, ודאו שהחלק העליון של הפרוסה פונה כלפי מעלה; זה הכרחי כדי לעקוב אחר החלק העליון, האמצעי והתחתון של פרוסה במהלך חתך וניתוח כמתואר בשלב 2.3.
2. למחרת, להעביר את הקלטות לתוך 70% EtOH, ומיד להמשיך עם שלב עיבוד רקמות הטבעת פרפין.
3. לפני עיבוד הרקמות, שטפו את ההיסטוקאזטות ב-100% EtOH 2x למשך 10 דקות כל אחת. במקרה זה, השתמש בתחנת מיקרוגל לעיבוד רקמות. בחר את התוכנית המשמשת לעובי רקמה של 1 מ"מ ופעל לפי ההוראות המפורטות במדריך (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   הערה: בעת שימוש במכונות עיבוד רקמות אחרות, השתמש בתוכנית המתאימה לדגימות רקמות דקות.
4. להטמעת פרפין, פתחו היסטוסט והשתמשו באזמל כדי להרים בזהירות את הפרוסה מנייר הסינון. משליכים את נייר הפילטר ומעבירים את הפרוסה לתבנית המכילה פרפין נוזלי.
   1. לחץ את הרקמה על תחתית תבנית ההטבעה, למשל עם משקל שטוח, כדי להבטיח חתך אחיד. מניחים את החלק התחתון של ההיסטוקסט על גבי התבנית, מוסיפים עליו פרפין נוזלי. מניחים לתבנית להתקרר על פטה קר למשך 30 דקות, ומפרידים את התבנית מגוש הפרפין.
      הערה: כחלופה להטבעה אופקית, ניתן להטמיע את פרוסת הגידול אנכית על ידי מיקום הפרוסה במצב זקוף. מקטעים אנכיים מאפשרים בקלות ניתוח של מעברי צבע בכדאיות או ביטוי סמן פונקציונלי בקטע יחיד. ניתוח הדרגתי עם פרוסות מוטבעות אופקית דורש חתך פרפין כמתואר בשלב 2.2.

2. עיבוד וניתוח של רקמות קבועות פורמלין ומשובצות פרפין (FFPE)

1. הכינו מקטעים דקים בגודל 4 מיקרומטר של גושי פרוסת רקמת FFPE באמצעות מיקרוטום. בעת החיתוך, התאם את זווית הבלוק כך שפני השטח של הבלוק יהיו בכיוון אופקי ביחס ללהב; זה הכרחי כדי להשיג אפילו חלקים בכל הרקמה.
2. כדי לאפשר לכידה של שיפוע כדאיות פוטנציאלי המושרה על-ידי תרבית, נדידת תאים בין הפרוסות או מעברי צבע בביטוי סמנים ביולוגיים על-פני פרוסות בתרבית, אספו מקטעים מהשכבות העליונות, המרכזיות והתחתונות של כל אחת מפרוסות הרקמה בשקופיות אובייקטים, כמוסבר להלן.
3. אספו תחילה קטעי רקמה רציפים של פרוסת הרקמה המשובצת בפרפין בחלק העליון של מגלשות הזכוכית. המשיכו לאסוף את החלקים של שכבות הרקמה העמוקות יותר לאמצע, ולאחר מכן את החלק התחתון של שקופיות הזכוכית (איור 1E).
   הערה: כדי להכיל שלושה חלקים במגלשת זכוכית, קצצו את עודפי הפרפין המקיפים את פרוסת הרקמה המשובצת.
4. הניחו לחלקים להתייבש למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C, והמשיכו עם צביעת H&E או אימונוהיסטוכימיה כמתואר להלן.
   הערה: אובדן אנטיגניות יכול להתרחש כאשר קטעי FFPE מאוחסנים בטמפרטורות גבוהות או לפרקי זמן ממושכים. קטעי פרפין מומלץ לאחסן ב 4 ° C, וניתוח IHC צריך להתבצע בתוך 6 חודשים לאחר החתך.
   1. להכתמת H&E, יש לנטרל את הפרפין ולהחזיר לו לחות באופן הבא: קסילן 3x למשך 5 דקות, 100% EtOH 3x למשך דקה אחת, 96% EtOH 2x למשך דקה אחת, 70% EtOH 1 x 1 דקה, ומים נטולי יונים, פעמיים למשך דקה אחת.
   2. יש לדגור על המקטעים בתמיסת המטוקסילין מסוננת טרייה למשך 10 דקות, ולשטוף תחת מי ברז זורמים למשך 5 דקות. לטבול את המקטעים באלכוהול חומצי (1% HCl ב-70% EtOH) במשך 2 פעמים, ולשטוף תחת מי ברז זורמים למשך 5 דקות ולאחר מכן לדגור עם 0.5% אאוזין למשך 2 דקות.
   3. לאחר שלב האוזין, יש לייבש את המקטעים על ידי טבילת המגלשות בתמיסות אלכוהול וקסילן, כדלקמן: 96% EtOH 2x עבור 15 שניות, 100% EtOH 3x עבור 30 שניות, קסילן 3x למשך דקה אחת. לבסוף, הטמע את המקטעים באמצעי הרכבה מבוסס קסילן.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של תהליך העבודה להקמה וניתוח של פרוסות פרוסות שמקורן בגידול NSCLC.(A) סכמטי המתאר את האיסוף וההכנה של ריאות נושאות גידול לחיתוך. אונות הריאה נקצרות מעכבר ורקמת הגידול מנותחת הרחק מרקמה נורמלית. ראש החץ השחור והכוכבית מצביעים על גידולים בקוטר 4 מ"מ ו-1 מ"מ, בהתאמה. ראש החץ הלבן מציין רקמת ריאה המודבקת לפני השטח של מחזיק הדגימה. החץ האדום מצביע על פיסה נוספת של רקמת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית רקמה 10 ס"מ	זארשטדט	83.1802
PBS	לונזה	BE17-517Q
פורמלדהיד	פישר	פ/1501/PB08
נייר קלטת היסטו משולש	אבחון סרטן	DX26280
קלטות היסטו	VWR	720-2199
מיקרוטום	תרמו פישר סיינטיפיק	HM355S
Leica VT1200 S מיקרוטום להב רוטט	לייקה ביוסיסטמס	14048142066
המטוקסילין לצביעת H&E	מרק	1.09249.0500
Hematoxylin עבור צביעה נגד	דקו	S3309
אאוסין	סיגמא	E4382
תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)	סיגמא	H6648