יישום אולטרסאונד בתדר נמוך: שיטה לקביעת השפעת הסוניקציה על תאי לוקמיה אנושיים

תקציר

מקור: Trendowski, M. et al. דור וניתוח כמותי של אולטרסאונד פועם בתדר נמוך כדי לקבוע את הרגישות הקולית של תאים ניאופלסטיים לא מטופלים ומטופלים. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מתאר את הנזק הסלקטיבי של תאי לוקמיה אנושיים באמצעות אולטרסאונד בתדר נמוך. יישום זה של אולטרסאונד בתדר נמוך במצב פרה-קליני במבחנה מדגים כי ניתן להשיג הרס תאים על מנת לבחון ולהשוות את ההשפעות של סוניקציה על לוקמיה ותאים נורמליים.

פרוטוקול

1. הכנת תאים ומדיום

1. הכינו את המדיום באמצעות 240 מ"ל של Iscove's Modified Dubecco's Medium (IMDM) וסרום בקר עוברי 50 מ"ל. אין להפשיר נסיוב בקר עוברי באמבט מים חמים, שכן עלייה מהירה בטמפרטורה עלולה להוביל לפשרה ביציבות הסרום. ערבבו 240 מיקרוליטר גנטמיצין 50 מ"ג/מ"ל ו-5 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין 100x בצלוחית תרבית סטנדרטית, והוסיפו למדיום. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C.
2. זרע U937 תאים ב~ 4 x 10⁴ תאים / מ"ל בבקבוק²⁵ ס"מ 2 באמצעות המדיום המוכן. להעריך את הריכוז והכדאיות של התאים באמצעות מונה תאים TC20 והרחקת כחול טריפאן על ידי הצבת 15-20 מיקרוליטר תאים ו-15-20 מיקרוליטר טריפאן כחול לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה וערבוב התכולה. Pipette15-20 μl של תערובת זו לתוך שקופית דגימה TC20, וליזום ספירה על ידי הצבת השקופית לתוך מונה התאים TC20.
3. דגרו על תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2, ובדקו את כדאיות התאים באמצעות הרחקת טריפאן כחול ומונה התאים TC20. כאשר התאים נמצאים בריכוז מתאים ו/או טופלו בסונוסנסיטייזרים למסגרת זמן מתאימה, העבירו 3 מ"ל תאים מבקבוק התרבית לבקבוקון זכוכית של 20 מ"ל. בפרוטוקול זה, לגדל תאי U937 במשך 48 שעות, ולאחר מכן לטפל עם 0.5, 1, או 5 mM MeβCD במשך 30 דקות כדי לרוקן מספיק את הכולסטרול של התאים לפני סוניקציה.

2. תא סוניקציה

1. דגה דה-יוניזציה, מים מזוקקים באמצעות ואקום וצלוחית בוכנר. מעבירים את המים לקרן הכוס, וממלאים עד לגובה של 15 מ"מ מעל ראש הקרן. תהליך הסוניקציה גורם לפירוק נוסף של המים למשך מספר דקות, ויכול להוביל לחוסר עקביות במהלך הניסוי אם המערכת אינה מופעלת לפני הסוניקציה של הדגימה. לכן, הפעל את המערכת במשך ~ 7 דקות לפני סוניקציה דגימה.
2. חברו את בקבוקון הנצנוץ המכיל את התאים למכשיר ההחזקה. לאחר מכן, חברו את מכשיר האחיזה לחלק העליון של קרן הכוס והגדירו לגובה של 15 מ"מ מראש הקרן (על פני המים באמצעות מנגנון ההחלקה).
3. התאים בדרך כלל עוברים סוניקציה באמצעות שלוש פעימות של 1 שניות של אולטרסאונד, עם מרווח של שנייה אחת בין כל אחת מהפולסים הללו. עבור פרוטוקול זה, סוניק תאים באמפליטודה של 33% ו- 50% באמצעות מינון הפולסים שהוזכר לעיל.

3. הערכת תאים לנזק לאחר סוניקציה

1. הערך את התאים המרחפים עבור נזק וכדאיות באמצעות כחול טריפאן ומונה התאים TC20. בנוסף, נתח את המדגם באמצעות מונה Z2. עבור ניתוח מונה Z2, פיפטה תרחיף תא 100 μl לתוך 20 מ"ל מלוחים איזוטוניים (יחס 200:1). לפני הניתוח, יש לשטוף את הצמצם של מנתח החלקיקים Z2 לפחות פעמיים באמצעות מי מלח איזוטוניים. הניחו את דגימת Z2 במחזיק הדלפק, והגביהו את הפלטפורמה לצמצם לפני תחילת הספירה.
2. רכוש את הנתונים מדלפקי TC20 ו- Z2 באמצעות תוכנה שסופקה על ידי היצרן. נתח נתונים אלה עבור נזק לתאים, כדאיות, ויצירת פסולת תאית מסוניקציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Medium של Dulbecco של Iscove עם NaHCO3 & 25mM Hepes	לייף טכנולוגיות	12440079
סרום בקר עוברי	סיגמא-אולדריץ'	12105
גנטמיצין 50 מ"ג/מ"ל	סיגמא-אולדריץ'	G1397
פניצילין/סטרפטומיצין 100x פתרון	לייף טכנולוגיות	10378-016
מונה תאים אוטומטי Bio-Rad TC20	ביו-ראד	145-0102
פתרון כחול טריפאן	סיגמא-אולדריץ'	T8154
פלקון 50 מ"ל ו-25 מ"ל צלוחיות תרבית מאווררות	פישר סיינטיפיק	353082
100 מיקרופיפטה מיקרופיפטה	וויטון	851164
1,000 מיקרופיפטה מיקרופיפטה	וויטון	851168
U937 תאי לוקמיה מונוציטיים אנושיים	ATCC	CRL1593.2
THP1 תאי לוקמיה מונוציטיים אנושיים	ATCC	TIB-202
משבש תאים Branson SLPe 40kHz עם Cuphorn בגודל 3 אינץ' (25 מ"מ)	ברנסון אולטרסאונד	101-063-726	התקן סוניקציה
גודל תא Beckman-Coulter Z2 עם תוכנת AccuComp®	בקמן-קולטר	6605700
Seal-Rite 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	ארה"ב סיינטיפיק	1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 מ"ל בקבוקונים וכמוסות	בקמן-קולטר	A35473
AccuJet Pro אוטומטי Pipet	ברנדטק סיינטיפיק	26330
USA סיינטיפיק 10 מ"ל פייפטים סרולוגיים חד פעמיים	ארה"ב סיינטיפיק	1071-0810
טיפ אחד 100 μl ו 1,000 μl טיפים מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1120-1840, 1126-7810
שקופיות ספירת תאים כפולות BioRad	ביו-ראד	145-0015
20 מ"ל בקבוקוני זכוכית מנצנצים	סיגמא-אולדריץ'	Z190527
Wheaton 250 מ"ל צלוחיות	סיגמא-אולדריץ'	Z364827