בדיקת XTT: בדיקה קולורימטרית להערכת כדאיות התא ופעילות המיטוכונדריה

תקציר

Trendowski, M., et al. דור וניתוח כמותי של אולטרסאונד פועם בתדר נמוך כדי לקבוע את הרגישות הקולית של תאים ניאופלסטיים לא מטופלים ומטופלים. J. Vis. Exp. (2015)

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול עבור בדיקת XTT שהוא בדיקה קולורימטרית להערכת כדאיות התא ופעילות המיטוכונדריה.

פרוטוקול

1. בדיקת XTT לקביעת כדאיות התא והפעילות המיטוכונדריאלית של תאי U937 ו-THP1 שטופלו

1. לפני בדיקות XTT, גדל תאי U937 ו- THP1 באותם תנאים. יש לטפל בתאים בעלי אותו טווח ריכוז של MeβCD במשך 30 דקות לפני סוניקציה. השתמש באותם פרמטרים של אולטרסאונד כמו בעבר, פרט לכך שהתאים עוברים כעת סוניקציה באמצעות טווח של 1-3 פולסים של שנייה אחת במרווחים של שנייה אחת זה מזה כדי לפתח טווח נזק עבור ערכת XTT להעריך.
   הערה: רבים מצעדים אלה נלקחים ישירות ממדריך ערכת XTT וחוזרים על עצמם רק לנוחיות המעבדות המעוניינות.
2. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות. להשהות מחדש את גלולת התא במדיום הגידול שתואר קודם לכן. השהה מחדש תאים ב~1 x 10⁵ תאים / מ"ל. זרע תאי U937 ב 100 μl לכל באר לתוך צלחת microtiter 96 באר שטוחה במשולש, ולאחר מכן לחזור על תאים THP1 באמצעות צלחת נפרדת 96 באר. כלול 3 בארות בקרה המכילות 100 μl של מצע גידול מלא בלבד כקריאות ספיגה ריקות. לאחר מכן, לדגור על הצלחות המחוסנות במשך 24 שעות.
3. הפשיר שני aliquots של מגיב XTT ואת מגיב ההפעלה ב 37 ° C לפני השימוש. מערבלים בעדינות עד לקבלת פתרונות ברורים. הוסף 0.1 מ"ל של מגיב ההפעלה ל- 5.0 מ"ל של מגיב XTT, היוצר פתרון XTT מופעל מספיק עבור בדיקת צלחת מיקרוטיטר אחת של 96 בארות. חזור על התהליך עבור הצלחת השנייה.
4. הוסף 50 μl של פתרון activated-XTT לכל באר. החזירו את הצלחת לחממת CO₂ של תרבית התאים למשך שעתיים. נערו את הצלחת בעדינות לאחר תקופת הדגירה כדי לפזר באופן שווה את הצבע הכתום בבארות החיוביות. מדוד את הבליעה של בארות הבדיקה המכילות את התאים ואת בארות בקרת הרקע הריקות באורך גל בין 450-500 ננומטר באמצעות קורא לוחות microtiter.
5. אפס את קורא לוחות המיקרוטיטר באמצעות בארות הבקרה הריקות או הפחת את הערך הממוצע שלהם מהתוצאות הספציפיות. למדוד את הספיגה של כל בארות הבדיקה שוב באורך גל בין 630-690 ננומטר ולהפחית את הערכים מערכי 450-500 ננומטר המתקבלים. הערה: קביעת ספיגה שנייה זו מסייעת לסלק קריאות לא ספציפיות מתוצאות הבדיקה. בדיקת XTT חזרה על עצמה ארבע פעמים עבור שני קווי התא.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Medium של Iscove's Modified Dulbecco עם NaHCO3 ו-25mM Hepes	לייף טכנולוגיות	12440079
משבש תאים ברנסון SLPe 40kHz עם 3" (25 מ"מ) Cuphorn	ברנסון אולטרסאונד	101-063-726	סוניקציה מכשיר
טיפ אחד 100 μl ו 1,000 μl טיפים מסנן	ארה"ב סיינטיפיק	1120-1840, 1126-7810
100 מיקרופיפטה מיקרופיפטה	וויטון	851164
1000 מיקרופיפטה	וויטון	851168
פורמא סיינטיפיק מים דו-תאיים חממת מעילים	פורמה סיינטיפיק	3131
ערכת בדיקת התפשטות תאים XTT	ATCC	30-1011K
קורא Microplate 96-Well	קול-פאלמר	EW-13055-54
U937 תאי לוקמיה מונוציטיים אנושיים	ATCC	CRL1593.2
THP1 תאי לוקמיה מונוציטיים אנושיים	ATCC	TIB-202