בדיקת תיוג דופק Bromodeoxyuridine: טכניקה למדידת התפשטות תאים

תקציר

מקור: Welschinger R. et al. מעקב זמני אחר התקדמות מחזור התא באמצעות ציטומטריית זרימה ללא צורך בסנכרון. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון מתאר את בדיקת סימון הדופק המדורגת של תאי יונקים עם ברומודוקסיורידין (BrdU) למדידת התפשטות תאים. ספיגת BrdU מאפשרת מעקב זמני אחר תאים שהיו בשלב הסינתזה בנקודת זמן מסוימת, ללא צורך בסנכרון התאים.

פרוטוקול

1. פתרונות וריאגנטים

1. סל"ד מלא
   1. הוסף 56 מ"ל סרום עגל עוברי (FCS) ו 5.5 מ"ל של 200 מ"ל L-גלוטמין לבקבוק 500 מ"ל של RPMI-1640 בינוני.
2. פתרון מניות BrdU
   1. הכינו 32.5 mM BrdU (10 מ"ג/מ"ל) במי מלח חוצצים פוספט (DPBS) של Dulbecco.
3. BrdU RPMI מלא
   1. הוסף 6.2 μl של תמיסת מלאי BrdU ל- 10 מ"ל של RPMI מלא.
4. פתרון DNase
   1. הכינו 1 מ"ג DNase/ml ב-DPBS.
5. חיץ צביעה
   1. הכינו 3% FCS מומת חום ו-0.09% נתרן אזיד ב-DPBS.
6. עיין ברשימת החומרים לקבלת הגדרות של מאגר קיבוע, מאגר חלחול ומאגר שטיפה.

2. תאים

הערה: התאים לא גודלו בתרבית במשך יותר מ-6 חודשים. שיטה זו ניתנת להתאמה ישירה לכל קו תאים שאינו נדבק עם התאמות לצפיפות התא ולאמצעי התרבית. השתמש בתאים שגדלים באופן אקספוננציאלי בתחילת הניסוי.

1. שמור על תאי NALM6 בצלוחיות תרבית T-75 בסל"ד מלא. בצע את כל השלבים בתנאים סטריליים באמצעות ארון בטיחות ביולוגית Class II.
2. שמור על תאי NALM6 בין 1-2 x 10⁶ תאים למ"ל על ידי פיצול התרבית שלוש פעמים בשבוע.
3. יש לדגור ב-37°C ב-5%_CO2 באוויר.

3. תיוג דופק של תאים עם BrdU

זהירות: טפל ב- BrdU בזהירות מכיוון שהוא מוטגן וטרטוגן פוטנציאלי.

1. תאי צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות.
   הערה: העברת תאים למדיה טרייה משפרת את יכולת השחזור של התוצאות.
2. בצע ספירת תאים והשהה מחדש תאים בסל"ד מלא ב- 2 x 10⁶ תאים/מ"ל.
3. לדלל תאים 1 ב 2 עם BrdU RPMI מלא לייצר ריכוז תא סופי של 1 x 10⁶ תאים / ml.
4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO₂ למשך 45 דקות, ולאחר מכן לדלל תאים 1 ב-10 עם סל"ד מלא. תאי צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות בזהירות להשליך את כל supernatant.
5. השהה מחדש תאים בנפח קטן (~ 100 מיקרוליטר) של סל"ד מלא, בצע ספירת תאים והתאם ל- 1 x 10⁶ תאים / מ"ל.
6. פיפטה 1 מ"ל של תאים לתוך בארות של צלחת 48 באר. פיפטה 1 מ"ל של DPBS לתוך כל בארות פנויות כדי להשיג תוצאות לשחזור יותר.
7. יש לדגור ב-37°C ב-5%_CO2 באוויר לנקודות הזמן הרצויות, כאן 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ו-24 שעות
   הערה: משך הזמן יהיה תלוי במה שתכנון הניסוי שואף למדוד.
8. העבר את כל התאים לתוך צינורות FACS באמצעות פיפטה. יש לשטוף את הבאר ברצף עם 1 מ"ל נפחים של PBS עד לנפח כולל סופי של 5 מ"ל.
9. צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות בזהירות להסיר את כל supernatant. תאים מוכנים לצביעה, בצע זאת (סעיף 4) באופן מיידי.

4. צביעת תאים

הערה: אם נדרשת צביעת פני השטח של תאים, בצעו זאת לפני הקיבוע, וודאו שהתאים נשמרים בטמפרטורה של 4°C לכל אורכם.

1. יש להשהות מחדש תאים ב-100 μl של חיץ צביעה (לצביעת משטח אופציונלית, יש להוסיף את נפח הנוגדנים המומלץ לאנטיגנים על פני השטח ולדגור במשך 30 דקות ב-4°C).
2. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ צביעה, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 150 x גרם ומשליכים את supernatant.
   הערה: נוגדנים ספציפיים, ריכוז, זמן הדגירה וכו 'ישתנו בהתאם למטרות הניסוי הספציפיות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NALM6	DSMZ	ACC-128
5-ברומו-2′-דאוקסיורידין	סיגמא	B5002-1G
RPMI 1,640 עם L-Gln 500 מ"ל	לונזה	12-167F
DPBS	לונזה	17-512F
סרום בקר עוברי	פישרביוטק	FBS-7100113
אינקובטור CO2	בינדר	ג 150
צינורות FACS BD Falcon בגודל 12 x 75 מ"מ	BD Biosciences	352008
BD LSR FORTESSA ציטומטר זרימה	BD Biosciences	פורטסה
צנטריפוגה	ספינטרון	GT-175R