BrdU Immunofluorescence Staining: טכניקה לזיהוי תאים בשלבים שונים של מחזור התא

תקציר

מקור: Welschinger, R., et al. מעקב זמני אחר התקדמות מחזור התא באמצעות ציטומטריית זרימה ללא צורך בסנכרון. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקול לצביעת BrdU immunofluorescence. הטכניקה מאפשרת זיהוי תאים בשלבים שונים של מחזור התא. תוספת של צבעי DNA ותיוג נוגדנים מאפשרת ניתוח מפורט של גורל תאי שלב S בזמנים מאוחרים יותר.

פרוטוקול

1. פתרונות וריאגנטים

1. סל"ד מלא
   1. הוסף 56 מ"ל סרום עגל עוברי (FCS) ו 5.5 מ"ל של 200 מ"ל L-גלוטמין לבקבוק 500 מ"ל של RPMI-1640 בינוני.
2. פתרון DNase
   1. הכינו 1 מ"ג DNase/ml ב-DPBS.
3. חיץ צביעה
   1. הכינו 3% FCS מומת חום ו-0.09% נתרן אזיד ב-DPBS.
4. עיין ברשימת החומרים לקבלת הגדרות של מאגר קיבוע, מאגר חלחול ומאגר שטיפה.

2. צביעת תאים

הערה: אם נדרשת צביעת פני השטח של תאים, בצעו זאת לפני הקיבוע, וודאו שהתאים נשמרים בטמפרטורה של 4°C לכל אורכם.

1. יש להשהות מחדש תאים ב-100 μl של חיץ צביעה (לצביעת משטח אופציונלית, יש להוסיף את נפח הנוגדנים המומלץ לאנטיגנים על פני השטח ולדגור במשך 30 דקות ב-4°C).
2. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ צביעה, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 150 x גרם ומשליכים את supernatant.
   הערה: נוגדנים ספציפיים, ריכוז, זמן דגירה וכו 'ישתנו בהתאם למטרות הניסוי הספציפיות.
3. קיבוע וחלחול
   1. יש להשהות מחדש תאים ב-100 מיקרוליטר של חיץ קיבוע ולדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפה, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 150 x גרם ומשליכים את supernatant.
   3. להשהות תאים ב 100 μl של חיץ permeabilization ולדגור את התאים במשך 10 דקות על קרח.
   4. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפה, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 150 x גרם, ומשליכים את supernatant.
   5. יש להשהות מחדש תאים ב-100 מיקרוליטר של חיץ קיבוע לכל צינור ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפה, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 150 x גרם, ומשליכים את supernatant.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן במידת הצורך. התאים הקבועים יציבים במשך מספר ימים ב 4 ° C אם resuspended ב חיץ צביעה. הסר את חיץ הצביעה לאחר הצנטריפוגה לפני שתמשיך.
4. טיפול DNase
   1. להשהות מחדש תאים ב 100 μl של תמיסת DNase (30 מיקרוגרם של DNase/10⁶ תאים) ולדגור תאים במשך 1 שעה ב 37 ° C.
   2. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפה, צנטריפוגה ב 150 x גרם במשך 5 דקות ומשליכים supernatant.
5. צביעת נוגדנים
   הערה: צביעה עבור סמנים תוך תאיים שאינם BrdU יכולה להתבצע בו זמנית עם צביעת BrdU.
   1. חשוב: הכינו בקרות פיצוי המורכבות מתאים לא מוכתמים ותאים המסומנים בכל פלואורוכרום בודד. באופן אידיאלי, השתמש באותם נוגדנים לבקרות פיצוי כמו אלה המשמשים בצינורות הניסוי. עם זאת, אם זה לא אפשרי, להחליף נוגדנים אנטיגנים בעלי ביטוי גבוה מצומדים לאותו פלואורוכרום.
   2. להשהות מחדש את התאים ב 50 μl של חיץ לשטוף ולהוסיף 1 μl/10⁶ תאים של נוגדן BrdU.
      הערה: ניתן להוסיף גם נוגדנים מצומדים ישירות לאנטיגנים תוך-תאיים ספציפיים אחרים.
      הערה: נוגדנים להיסטון H3 פוספורילציה על Ser10 יכולים לשמש כדי להבחין בין תאים ב- G2 ו- M, היסטון H3 הוא פוספורילציה על Ser10 במהלך מיטוזה. נוגדנים לפוספורילציה cdc2 על Tyr15 יכולים לשמש לאיתור תאים שהתחייבו למיטוזה.
   3. דוגרים על התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ שטיפה, תאי צנטריפוגות ב 150 x גרם במשך 5 דקות ומשליכים supernatant.

6. Stain DNA לניתוח מחזור התא
   1. שחררו גלולה והוסיפו 20 μl של תמיסת 7-AAD (0.25 מיקרוגרם).
      הערה: חיוני להשתמש בכמות קבועה של 7-AAD/תא.
   2. להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מאגר צביעה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת זרימה APC BrdU	BD Biosciences	552598	מכיל נוגדן BrdU, 7-AAD ו-BD Cytofix/Cytoperm Buffer (המכונה Fixation Buffer)
BD Perm/Wash Buffer	BD Biosciences	554723	מכונה Wash buffer
BD Pharmingen חיץ כתמים	BD Biosciences	554656
פיפטמן	גילסון	P2, P20, P100, P1000
דנאז	סיגמא	D-4513
BD Cytoperm Permeabilization Buffer Plus	BD Biosciences	561651	מכונה מאגר חדירות
צנטריפוגה	ספינטרון	GT-175R
AF488 נוגדן נגד היסטון H3 פוספו (Ser10)	איתות סלולרי	9708S
פוספו-Chk2 (Thr68) (C13C1) ארנב mAb	איתות סלולרי	שנות ה-2197
פוספו-Chk1 (Ser345) (133D3) ארנב mAb	איתות סלולרי	2348שניות
צינורות FACS BD Falcon בגודל 12 x 75 מ"מ	BD Biosciences	352008