תרבית דו-ממדית של תאים לוקמיים עם BMSCs: שיטה להשגת תת-אוכלוסיות של תאים לוקמיים

תקציר

מקור: Slone, W. L. et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר את הטכניקה לתרבית משותפת דו-ממדית ארוכת טווח של תאי לוקמיה עם תאי סטרומה של מח עצם כדי לחקור את האינטראקציה שלהם עם מיקרו-סביבה של מח העצם. מודל ההתרבות הדו-ממדית משתמש בתאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה ובסטרומה או אוסטאובלסטים של מח העצם המשפיעים על פנוטיפ תאי הגידול. מחקר זה יתמוך בחקירת המנגנונים העומדים בבסיס הישרדות תאי לוקמיה הנתמכים על ידי מח עצם במהלך חשיפה לכימותרפיה.

פרוטוקול

1. הכנה מתקדמת

1. גידול תאי סטרומה של מח עצם (BMSC) ואוסטאובלסטים (OB).
   1. שמור על BMSC או OB ב 37 ° C ב 6% CO₂ וגדל על לוחות תרבית רקמה 10 ס"מ עד 90% מפגש הוא הגיע.
   2. טריפסיניזציה של תאי BMSC או OB ופיצול 1:2 ללוחות חדשים של 10 ס"מ. התאים גדלים בסטנדרטים אלה עד שיש צורך בתרבית משותפת לוקמית.

2. ביסוס ושימור תרבות משותפת

1. הוסף 5-20 x 10⁶ תאים לוקמיים ב 10 מ"ל של מדיה תרבית ספציפית לגידול על 80%-90% מפגש BMSC או צלחת OB.
   הערה: המעבדה שלנו שומרת על תרביות משותפות בטמפרטורה של 37°C ב-5% O₂ כדי לשחזר טוב יותר את המיקרו-סביבה של מח העצם, אשר הוכחה כנעה בין 1% ל-7%. עם זאת, שמירה על תרביות משותפות במתח חמצן זה אינה קריטית לביסוס שלוש תת-אוכלוסיות לוקמיות ונתונה לשיקול דעתה של המעבדה.
2. כל יום 4 יש להסיר את כל חומרי המדיה, למעט 1 מ"ל (כולל תאים לוקמיים בתרחיף) ולהחליף בתרבית לוקמית טרייה במינון 9 מ"ל. בעת הסרת 9 מ"ל של מדיה מהצלחת, היזהר לא להפריע לשכבת הדבק של תאי סטרומה של מח העצם (BMSC) או אוסטאובלסט (OB).
   1. מוציאים את המדיה על ידי הטיית הלוח הצידה ושואפים מדיה בפינת הצלחת. בנוסף, בעת הוספת מדיה טרייה, הקפד להוסיף טיפה חכמה בפינת הצלחת כנגד דופן הצד כדי להבטיח הפרעה מינימלית של שכבת הדבק BMSC או OOB.
3. לאחר היום ה -12 של תרבית משותפת, לשטוף תאים לוקמיים משכבת BMSC או OB על ידי צנרת מדיה תרבית מן צלחת למעלה ולמטה בעדינות על צלחת כ 5 עד 10 פעמים ולאחר מכן לאסוף צינור חרוטי 15 מ"ל. זרעו מחדש על צלחת BMSC או OB חדשה 80%-90% כמתואר בשלב 2.1.
   הערה: השטיפה העדינה של התרבית המשותפת כמתואר בשלב 2.3 תסיר תאים לוקמיים מרחפים ובהירים מבלי להפריע לחד-שכבה BMSC או OB. זה מאפשר רק לתאי הגידול להיות מועברים לצלחת התרבית המשותפת הבאה. ניתן לחזור על מחזור זה של 12 יום כמה פעמים לפי הצורך בהתאם לצרכי המשתמש.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 x 20 מ"מ כלים לתרביות תאים	גריינר ביו-וואן	664160
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	מוצרים רפואיים ברחבי העולם	41021037	משמש לאיסוף תאים
מדיה תרבותית
תקשורת תרבות אוסטאובלסט	PromoCell	C-27001	לתקשורת אוסטאובלסטים אנושית
מדיה RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	להכנת מדיה סרטנית
תאים דבקים
אוסטאובלסטים אנושיים	PromoCell	C-12720	אוסטאובלסטים אנושיים תורבתו על פי המלצות הספק.
תאי סטרומה של מור עצם אנושי	ליבת דגימה ביולוגית של WVU		לוקמיה אנושית ראשונית ותאי סטרומה ממח עצם (BMSC) שהוסרו מזיהוי סופקו על ידי מרכז הסרטן מרי באב רנדולף (MBRCC) Biospecimen Processing Core והמחלקה לפתולוגיה של אוניברסיטת מערב וירג'יניה בנק רקמות
תאים לוקמיים
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	תאי REH תורבתו בהתאם להמלצות הספק ולמדיה המומלצת.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 תורבתו בהתאם להמלצות הספק ולאמצעי התקשורת המומלצים.