קציר תת-אוכלוסיות לוקמי: שיטה להפרדה מרחבית של תת-אוכלוסיות תאים לוקמיים מתרבית משותפת דו-ממדית

Abstract

מקור: Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר שיטה להפרדה מרחבית של שלוש תת-אוכלוסיות של תאים לוקמיים: תאי לוקמיה מרחפים המרחפים בחופשיות במדיה, תאי לוקמיה בהירי פאזה שנצמדו לפני השטח של חד-שכבה של תאי סטרומה מזנכימליים, ותאי לוקמיה עמומים בפאזה שנדדו מתחת לחד-שכבה של תאי סטרומה מזנכימליים מתרבית דו-ממדית.

Protocol

1. הפרדת 3 תת-אוכלוסיות בתוך תרבות משותפת

1. אוסף של תת-אוכלוסיית גידול תרחיף (S).
   1. יש לשאוב מדיה מצלחת תרבית משותפת עם פיפטה ולמרוח בעדינות את אותה מדיה כדי לשטוף את הצלחת ולאסוף מדיה המכילה תאים לוקמיים בצינורית חרוטית של 15 מ"ל. התאים הלוקמיים שנאספו הם תת-האוכלוסייה S.
2. איסוף תת-אוכלוסיית גידולי פאזה בהירה (PB).
   1. הוסיפו 10 מ"ל מדיה טרייה בחזרה לצלחת התרבית המשותפת. יש לשטוף נמרצות על ידי צנרת מדיה נוספת למעלה ולמטה בערך 5 פעמים כדי להסיר תאים לוקמיים דבקים, אך לא חזק מספיק כדי לעקור רכיב BMSC/OB דבק.
   2. שואפים עם פיפטה ואוספים מדיה בצינור חרוטי של 15 מ"ל. התאים שנאספו הם תת-אוכלוסיית PB.
3. אוסף של תת-אוכלוסיית גידולי פאזה עמומים (PD).
   1. יש לשטוף את הצלחת ב-PBS של 1 מ"ל כדי להסיר את שאריות המדיה. טריפסיניזציה צלחת תרבית משותפת עם 3 מ"ל טריפסין ומניחים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
   2. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומקישים בעדינות על דפנות הצלחת כדי לעקור את הדבק BMSC/OB.
   3. הוסף 1 מ"ל סרום בקר עוברי (FBS) ופיפטה למעלה ולמטה 3-5 פעמים כדי לפרק צברי תאים גדולים.
   4. לאסוף מדיה עם תאים בצינור חרוטי 15 מ"ל. תאים אלה הם תת-אוכלוסיית PD לא מטוהרת עם BMSC/OB גם כן.
4. צנטריפוגה 3 תת-אוכלוסיות מבודדות ב 400 x גרם במשך 7 דקות. יש לשאוף ולהשליך את הסופרנאטנט ולאחר מכן להשהות מחדש בנפרד את הכדוריות ב-1 מ"ל מדיה מחוממת מראש. התאים מוכנים לטעינה בעמודת G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	מוצרים רפואיים ברחבי העולם	41021039	תמיסה משמרת עבור דגימות ציטולוגיה
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	נובציטים	נה	משמש לאיסוף תאים
סרום בקר עוברי	סיגמא	F6178
0.05% טריפסין	Mediatech, Inc	5229 TEC 5	25-053-CI
100 x 20 מ"מ כלים לתרביות תאים	גריינר ביו-וואן	664160
תרבות מדיה
תקשורת תרבות אוסטאובלסט	PromoCell	C-27001	לתקשורת אוסטאובלסטים אנושית
מדיה RPMI 1640	Mediatech, Inc.	15-040	להכנת מדיה סרטנית
Cell lines
אוסטאובלסטים אנושיים	PromoCell	C-12720	אוסטאובלסטים אנושיים תורבתו על פי המלצות הספק.
תאי סטרומה של מור עצם אנושי	ליבת דגימה ביולוגית של WVU		לוקמיה אנושית ראשונית ותאי סטרומה של מח עצם (BMSC) שהוסרו מזיהוי סופקו על ידי מרכז הסרטן מרי באב רנדולף (MBRCC) Biospecimen Processing Core והמחלקה לפתולוגיה של אוניברסיטת מערב וירג'יניה בנק הרקמות. תרבויות BMSC הוקמו כמתואר קודם לכן (*)
תאים לוקמיים
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	תאי REH תורבתו בהתאם להמלצות הספק ולמדיה המומלצת.
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 תורבתו בהתאם להמלצות הספק ולאמצעי התקשורת המומלצים.