מיון תאי לוקמיה מבוסס עמודות G-10: שיטה לטיהור תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה מתאי סטרומה של מח עצם

Abstract

מקור: Slone, W. L., et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מתאר את ההפרדה של תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה מתאי סטרומה של מח עצם באמצעות עשר עמודות דקסטרן G-10 צולבות מסוג ג'ל. שיטה זו מסייעת לשחזר את אוכלוסיית תאי הגידול שנדדו מתחת לתאי סטרומה של מח העצם הדבק ויצרו אוכלוסיית תאי גידול "עמומה פאזה".

Protocol

1. טעינת תאי תרבית משותפת לעמודת G10

הערה: ודא שהסטופקוק סגור לחלוטין לפני הוספת מדיה המכילה תאים לעמודת G10. כמו כן, יש לדרוס כל תת-אוכלוסייה על טור G10 נפרד כדי לא להציג שום הטיה בין אוכלוסיות בניתוח במורד הזרם.

1. באמצעות פיפטה של 1,000 μl, הוסף 1 מ"ל מכל תת-אוכלוסיית תאים במדיה מחוממת מראש לעמודת G10 נפרדת עם טיפת טיפה. ודא כי המדיה המכילה את התאים נשארת על גבי או בתוך גלולת G10. אפשר לתאים לדגור על גלולת G10 למשך 20 דקות ב- RT.
   הערה: סטופקוק נשאר סגור למשך הדגירה.

2. איסוף תאים לוקמיים מעמודת G10

1. הוסף 1-3 מ"ל מדיה מחוממת מראש לכל עמודת G10. פתח את שסתום הסטופקוק ואפשר למדיה לצאת באיטיות מהעמודה כלפי ירידה.
   הערה: חיוני לשמור על קצב זרימה איטי מהעמודה, אחרת גלולת G10 המכילה BMSC/OB יכולה להישטף החוצה מהעמוד ולזהם את התאים הלוקמיים המבודדים.
2. המשיכו להוסיף מדיה מחוממת מראש בדרגות קטנות (1-2 מ"ל) לעמודת G10 עד שסך הכל 15 עד 20 מ"ל יעבור את העמודה וייאסף. סגור שסתום סטופקוק וצינור איסוף כובע.
   הערה: אם גלולת חלקיקי G10 נראית בתחתית צינור האיסוף, הסר בעדינות מדיה מהצינור תוך השארת גלולת חלקיקי G10 ללא הפרעה והעבר לצינור חדש.
3. צנטריפוגה אספה מדיה ב 400 x גרם במשך 7 דקות ב RT. להסיר supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא בחיץ המתאים ליישום במורד הזרם.
4. תאים הם כעת אוכלוסייה טהורה של תאים לוקמיים ללא זיהום BMSC או OB והם מוכנים ליישום על יישומים במורד הזרם על פי שיקול דעת המשתמש.
   הערה: כדאיות התאים הלוקמיים צריכה להישאר ללא שינוי בעת העברת תאים דרך עמודות G10.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 חרוזי ספדקס	סיגמא	G10120	מכונה בכתב יד חלקיקי דקסטרן צולבים מסוג ג'ל 10
10 מ"ל מזרק סטרילי	ב.ד.	309604
סטופקוקים בכיוון אחד	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
אוסטאובלסטים אנושיים	PromoCell	C-12720	אוסטאובלסטים אנושיים תורבתו על פי המלצות הספק.
תאי סטרומה של מור עצם אנושי	ליבת דגימה ביולוגית של WVU		לוקמיה אנושית ראשונית ותאי סטרומה של מח עצם (BMSC) שהוסרו מזיהוי סופקו על ידי מרכז הסרטן מרי באב רנדולף (MBRCC) Biospecimen Processing Core והמחלקה לפתולוגיה של אוניברסיטת מערב וירג'יניה בנק הרקמות. תרבויות BMSC הוקמו כמתואר קודם לכן (*)
0.05% טריפסין	Mediatech, Inc.	25-053-CI
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	תאי REH תורבתו בהתאם להמלצות הספק ולמדיה המומלצת
צמר זכוכית	פירקס	3950
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	מוצרים רפואיים ברחבי העולם	41021039	משמש כצינורות איסוף
15 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	מוצרים רפואיים ברחבי העולם	41021037	משמש לאיסוף תאים
סרום בקר עוברי	סיגמא	F6178
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 תורבתו בהתאם להמלצות הספק ולאמצעי התקשורת המומלצים
100 x 20 מ"מ כלים לתרביות תאים	גריינר ביו-וואן	664160