מאמר שיטה

דגימת דם רטרו-מסלולית: שיטה לבידוד תאים חד-גרעיניים מהסינוס הרטרו-אורביטלי של עכבר

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Mopin A. et al. פרוטוקול מפורט לאפיון קו התאים Murine C1498 ומודל עכבר לוקמיה הקשור אליו. J. Vis. Exp. (2016)

הסרטון מתאר שיטת דגימה לאיסוף דם היקפי מסינוס רטרו-אורביטלי של עכבר ובידוד נוסף של תאים חד-גרעיניים מדם באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. איסוף דם רטרו אורביטלי

  1. בצע איסוף דם רטרו אורביטלי ממש לפני המתת חסד בתנאים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרית ותחת מנורת חימום למניעת היפותרמיה.
  2. להרדמה, יש להשתמש בקטמין במינון של 150 מ"ג/ק"ג ובקסילזין במינון של 10 מ"ג/ק"ג. הכן את פתרון ההרדמה על ידי דילול 1.5 מ"ל של קטמין ו 0.5 מ"ל של xylazine ב 18 מ"ל של פתרון PBS.
  3. הכנס צינור נימי לתוך הקנטוס המדיאלי של העין. הדם יעלה מהסינוס האורביטלי לתוך צינור הנימים. שלוט בדימום על ידי הפעלת לחץ עדין על העין עם ספוג גזה סטרילי.
    הערה: נפח של 100 עד 200 μl של דם ניתן לאסוף באמצעות טכניקה זו.
  4. אספו את הדם לתוך צינור EDTA, ואחסנו את הדגימה על קרח לפני בידוד התאים החד-גרעיניים.

2. בידוד תאי דם חד-גרעיניים

  1. העבירו את דגימת הדם (100 עד 200 מיקרוליטר; המתקבלת משלב 1.1) לצינור מיקרוצנטריפוגה, והוסיפו תמיסת PBS/1 mM EDTA עד שנפח התמיסה הוא 500 מיקרוליטר. בזהירות שכבה 500 μl של תמיסת הפרדה מתחת לתמיסה המכילה את הדם באמצעות מחט 30G מזרק 1 מ"ל. אין לערבב את הדם ואת תמיסת ההפרדה.
  2. צנטריפוגה את הצינורות ב 800 x גרם (ללא בלם) במשך 20 דקות ב RT. לאחר הצנטריפוגה, אוספים את טבעת התא (השכבה הלבנה האטומה) באמצעות פיפטה. העברת התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה.
    הערה: השכבה הלבנה האטומה מכילה לימפוציטים וכן מונוציטים ומופיעה בין השכבה התחתונה - התמיסה המפרידה - לבין השכבה העליונה.
  3. הוסף 1 מ"ל של תמיסת PBS, וצנטריפוגה את הצינור ב 350 x גרם למשך 10 דקות. להשהות מחדש את התאים ב 600 μl של מאגר FACS.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קטמין 1000 (100 מ"ג/מ"ל) VIRBAC 3.59713E+12
קסילזין סדקסילן (20 מ"ג/מ"ל) סיוה
פתרון PBS (תרכיז אחד) תרמופישר סיינטיפיק 14190
פתרון EDTA טהור במיוחד באורך 0.5 מ', pH 8.0 תרמופישר סיינטיפיק 15575
פתרון הפרדה (Pancoll Mouse) פנביוטק פ04-64100
צינור EDTA גריינר ביו-וואן 454034
פסטר פיפטה 150 מ"מ (צינור נימי) פישרברנד 1154-6963
צינורות ציטומטריה של זרימה (כחול) בקמן קולטר 2523749
צינור מיקרוצנטריפוגה (1.5 מ"ל) תרמופישר סיינטיפיק 05-408-129
ספוגי גזה סטריליים אורגו 501580
30 גר' מחט בקטון ודיקינסון 304000
1 מ"ל מזרק תרומו SS-01T
שנדון ציטוספין 3 ציטוצנטריפוגה תרמופישר סיינטיפיק

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EDTAPBSFACSC1498

מאמרים קשורים