$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. במבחנה אפיון קו התא C1498
- תרבית חוץ גופית של תאי C1498
- הכנת RPMI מלא (Roswell Park Memorial Institute) 1640 בינוני על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 5 מ"ל של פניצילין (100 U / ml)-streptomycin (100 מיקרוגרם / מ"ל), 500 μl של 50 mM β-mercaptoethanol, 5 מ"ל של N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane חומצה סולפונית (HEPES), 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות ו 5 מ"ל של פירובט נתרן ל 500 מ"ל של מדיום RPMI.
- הגדל את קו התאים C1498 בסל"ד מלא. קוצרים את התאים בתרחיף על ידי פיפטינג, ומעבירים את התאים לצינור של 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant.
- מוסיפים 20 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) (1x), צנטריפוגה ב 350 x גרם למשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant.
- יש להשהות מחדש את התאים ב-10 מ"ל של מאגר סדרן תאים מופעל פלואורסצנטי (FAC) (2.5 גרם אבקת אלבומין בסרום בקר (BSA) ו-2 מ"ל של תמיסת חומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) ב-500 מ"ל של תמיסת PBS). ספרו את התאים באמצעות תא ספירה של תאי תומא לאחר צביעת התאים בכחול טריפאן.
2. הכנת תרחיף תא על שקופיות למיקרוסקופ
- שטפו 106 מתאי C1498 שנקטפו (המתקבלים בשלב 1.1.4) עם 5 מ"ל של חיץ FACs קרים פעמיים, ודללו את התאים ב-1 מ"ל של חיץ FAC קר. מניחים את הצינורות על קרח.
- הכניסו את המגלשות לתאים חד פעמיים עם כרטיסי סינון מחוברים מראש והכניסו אותן לציטוצנטריפוגה.
- הוסף 100 μl של מאגר FACs לכל תא וכרטיס סינון, וסובב אותם במשך 2 דקות ב 4.52 x גרם.
- הוסף 100 μl של תאים לכל תא וכרטיס סינון, וסובב את התאים ב 4.52 x g במשך 2 דקות.
- הסירו בזהירות את המגלשות מהתאים וייבשו את המגלשות באוויר לפני שאתם מכתימים אותן בכתם מאי-גרינוולד גימסה.
3. צביעת מאי-גרינוולד גימסה (MGG)
- מכתימים את התאים (שהוכנו בסעיף 2) על ידי טבילת המגלשות בצנצנת קופלין המכילה תמיסת מאי-גרינוולד למשך 3 דקות.
- מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין המכילה את תמיסת החיץ pH 6.8 למשך דקה אחת.
- צבעו את המגלשות על ידי הכנסתן לצנצנת קופלין המכילה את תמיסת Giemsa R (מדוללת ל-1/20 בתמיסת חיץ pH 6.8) למשך 10 דקות. שטפו את המגלשות במים ניטרליים (pH 7) למשך 10 שניות.
- מסננים ומייבשים את המגלשות באוויר. הרכבה של השקופיות על-ידי החלת טיפה אחת של אמצעי הרכבה 2 על התאים. הניחו קצה אחד של זכוכית הכיסוי על המגלשה והורידו אותו בזהירות אל התאים באמצעות מלקחיים. לחצו בעדינות על זכוכית הכיסוי כדי להסיר בועות אוויר.