צנטריפוגת שיפוע צפיפות: שיטה לבידוד תאי CLL מדם היקפי

Abstract

מקור: Hay, J. et al. שבירה תת-תאית של תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית ראשונית לניטור סחר בחלבונים גרעיניים/ציטופלזמיים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הטכניקה של בידוד תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) מדם היקפי. באמצעות פרוטוקול זה, נבודד תאי CLL מדגימת דם של מטופלים אנושיים לצורך יצירה יעילה לאחר מכן של שברים גרעיניים וציטופלזמיים.

Protocol

1. בידוד תאי CLL מדגימות דם של מטופלים

1. דגימות דם היקפיות מחולי CLL שהסכימו לכך בעבר מתקבלות מהמרפאה בצינורות איסוף דם EDTA, בליווי ספירת התאים הלבנים (WCC). לטהר את דגימות הדם ההיקפיות CLL על פי WCC. עבור WCC < 40 x 10⁶ תאים/מ"ל, המשך לשלב 1.1.1; עבור WCC ≥⁴⁰ x 10 6 תאים/מ"ל, המשך לשלב 1.1.2.
   1. יוצקים את התוכן של כל צינורות הדם EDTA לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל ולהוסיף 50 μL של קוקטייל העשרה תאי B אנושיים לכל 1 מ"ל של דם. יש לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות. המשך לשלב 1.1.2.
   2. דללו את הדגימה ביחס של 1:1 עם מאגר שטיפה RT CLL (מלח חוצץ פוספט (PBS), סרום בקר עוברי 0.5% (FBS) ו-2 mM EDTA).
2. Aliquot RT צפיפות הדרגתית מדיה לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי בגודל מתאים עבור הדגימה (10 מ"ל לתוך צינור 50 מ"ל עבור 30 מ"ל של דגימה או 4 מ"ל לתוך צינור 15 מ"ל עבור 10 מ"ל של דגימה).
3. שכבות בזהירות את הדגימה על גבי מדיית שיפוע הצפיפות והצנטריפוגה ב- 400 x גרם למשך 30 דקות ב- RT.
   הערה: ודא שהצנטריפוגה נמצאת ב- RT לפני הכנסת הדגימות לצנטריפוגה מכיוון ששינוי בטמפרטורה יגרום להעשרה גרועה של תאים חד-גרעיניים, וכבה את הבלם בצנטריפוגה, מכיוון שבלימה פתאומית עלולה לשבש את ממשק הנוזל.
4. קצרו בעדינות את השכבה הלבנה של התאים החד-גרעיניים הנאספים בממשק של מדיית שיפוע הצפיפות וחיץ השטיפה CLL, לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי טרי של 50 מ"ל באמצעות פיפטה פלסטית של פסטר.
5. הוסף 40 מ"ל של חיץ שטיפה CLL לשכבה המובודדת כדי לשטוף את התאים והצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 10 דקות ב- RT.
6. השליכו את הסופרנטנט, השהו מחדש את הגלולה על ידי הזזת תחתית הצינור, ואז חזרו על שלב השטיפה המתואר בשלב 1.5.
7. השליכו את הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה כמתואר בשלב 1.6, ולאחר מכן השעו מחדש את הגלולה בנפח מוגדר של מאגר שטיפה CLL (עד 40 מ"ל, תלוי בגודל גלולת התא).
8. ספרו את התאים באמצעות טריפאן כחול והמוציטומטר. לאחר מכן המשך לציטומטריה זרימה כדי לבדוק את טוהר תאי CLL.
   הערה: בשלב זה, ניתן לגדל את תאי ה-CLL בתרבית בריכוז של 10 x 10⁶ תאים/מ"ל במדיה לשימוש בניסויים, ו/או לשמר אותם בהקפאה ב-10% דימתיל סולפוקסיד (DMSO)/FBS לעבודה עתידית בריכוזים של עד 100 x 10⁶ תאים/בקבוקון.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 מ"ל צינור	גריינר ביו אחד	188271
1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה	גריינר ביו אחד	616201
DMSO	סיגמא	D2650
EDTA	סיגמא	עורכים
סרום בקר עוברי	תרמופישר	10500064
מדיית מעבר צבע צפיפות Histopaque1077	סיגמא	H8889
פתרון כחול טריפאן	תרמופישר	15250061
טבליות PBS	פישר סיינטיפיק	BR0014G
RosetteSep קוקטייל העשרה של תאי B אנושיים	טכנולוגיות תאי גזע	15064
סיגמא 3-16P	SciQuip		צנטריפוגה