$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת שברים תת-תאיים מתאי CLL
הערה: בעת תכנון מערך הניסוי, כלול באר של תאים לא מגורים/לא מטופלים שמהם ניתן להפיק את תמצית התא כולו.
- בצע את הגירוי ו / או הטיפול התרופתי הרצוי בקו תאי MEC1 CLL או תאי CLL ראשוניים מבודדים באמצעות 10 – 20 x 106 תאים / מצב. לאחר מכן תאים ישמשו לשבירה תת-תאית או ליצירת תמצית תאים שלמים כמוסבר להלן:
- הכנת תמיסות/צינורות: הכינו את כל התמיסות/חוצצים טריים ביום השבירה לפני קצירת התאים. אחסנו את התמיסות על קרח עד לנדרש והשתמשו תוך 4 שעות מההכנה.
- תמיסת מעכבי PBS/phosphatase: הכן את מעכבי phosphatase ב- PBS על ידי דילול מעכבי phosphatase 1:20 ב- 1x PBS (כלומר, 0.5 מ"ל של מעכבי phosphatase ב- 9.5 מ"ל של 1x PBS).
הערה: ודא שמעכבי phosphatase לא זירזו. אם קיים משקע, יש לחמם ל-50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- חיץ היפוטוני: הכינו חיץ היפוטוני 1x על ידי ביצוע דילול 1:10 של חיץ היפוטוני 10x במים מזוקקים (כלומר, 50 μL של 10x חיץ היפוטוני לתוך 450 μ L של dH2O).
- 10 mM dithiothreitol (DTT): הכינו DTT של 10 mM על ידי ביצוע דילול 1:100 של 1M DTT עם מים מזוקקים (כלומר, 10 μL של 1 M DTT ב-990 μL של dH2O).
הערה: DTT הוא מאוד labile אז להכין את זה טרי בכל פעם. הימנעו ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים.
- מאגר ליזה מלא: קבע כמה מאגר נדרש עבור כל ניסוי. כל דגימה דורשת 50 μL של חיץ ליזה מלא, לכן יש להוסיף 5 μL של 10 mM DTT ל-44.5 μL של חיץ ליזה ולאחר מכן להוסיף 0.5 μL של קוקטייל מעכבי פרוטאזות. ניתן להגדיל כמות זו בהתאם למספר הדגימות בניסוי.
- תייגו ארבע קבוצות של צינורות מיקרופוגה בנפח 1.5 מ"ל עבור כל גירוי ו/או טיפול תרופתי עבור התאים הטריים שעוררו, השברים הציטופלזמיים שזה עתה נוצרו, השברים הגרעיניים שזה עתה נוצרו והליזטים של התא כולו. מצננים מראש את צינורות המיקרופוגה על קרח עד לצורך.
- העבר את התאים לתוך צינורות מיקרופוגה 1.5 מ"ל מסומנים בנפרד וגלולה על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של מעכבי PBS / phosphatase קר כקרח. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להסיר את supernatant ולשמור את כדורי התא על קרח.
- הכנת שברים ציטופלזמיים: השהה מחדש בעדינות את כדורי התא כדי שישמשו לשבירה תת-תאית ב 50 μL של 1x חיץ היפוטוני. לדגור על התאים על קרח במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתנפח.
הערה: ניתן להגדיל את נפח המאגר ההיפוטוני המשמש באופן אמפירי בהתאם למספר התא.
- הוסף 0.8 - 2.5 μL (1:20 עד 1:60) של חומר ניקוי לכל דגימה ומערבולת בהגדרה הגבוהה ביותר למשך 10 שניות.
- כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי של חומר ניקוי לשימוש עבור סוג תא מסוים כדי לבודד שברים גרעיניים וציטופלזמיים, לבצע שיפוע דטרגנט בתחילה. טווח של 1:20 עד 1:60 (כלומר, 2.5 μL עד 0.8 μL של חומר ניקוי לתוך 50 μL של חיץ היפוטוני) צריך להיות מספיק.
הערה: אם עוצמת המאגר ההיפוטוני בשלב 3.4 מותאמת, ודא שיחס חומרי הניקוי המתאים נשמר.
- אמת ליזה של התא על ידי התבוננות בתאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה לפני ואחרי הוספת חומר ניקוי. תאים שלמים נראים גדולים יותר עם גרעין צפוף וכהה. הציטופלסמה תופיע כהילה בהירה סביב הגרעין.
הערה: ליזה מתאימה מאושרת עוד יותר על ידי שימוש בקרישה מערבית כדי לנתח חלבונים ספציפיים בתוך שברי הליזה הנוצרים משיפוע הדטרגנטים.
- לאחר ליזה, צנטריפוגה את הדגימות ב 14,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C.
- מעבירים בזהירות את הסופרנאטנט לתוך צינור מיקרופוגה מקורר מראש. ניתן לאחסן חלק ציטופלזמי זה ב -80 ° C עד שיידרש לניתוח נוסף. הגלולה הנותרת מכילה את החלק הגרעיני.
הערה: יש להימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים של הדגימות.
- הכנת שברים גרעיניים: להשהות מחדש כל גלולה גרעינית ב 50 μL של חיץ ליזה מלא על ידי pipeting למעלה ולמטה.
הערה: ניתן לכוונן אמפירית את נפח מאגר הליזיס המלא בהתאם למספר התא ההתחלתי.
- הוסף 2.5 μL של חומר ניקוי כדי להמיס חלבונים הקשורים לקרום הגרעין ולמערבולת במצב הגבוה ביותר למשך 10 שניות. דגרו את הדגימות על קרח במשך 30 דקות.
- מערבולת על ההגדרה הגבוהה ביותר במשך 30 שניות, ולאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C.
- מעבירים את הסופרנאטנט לתוך צינור מיקרופוגה מקורר מראש. ניתן לאחסן חלק גרעיני זה ב -80 ° C עד שיידרש לניתוח נוסף.
הערה: יש להימנע ממחזורי הקפאה/הפשרה חוזרים ונשנים של הדגימות.