בדיקת שטף חוץ-תאי: שיטה למדידת פרופיל מטבולי של תאים

תקציר

מקור: Hlozkova K. et al. הערכת הפרופיל המטבולי של תאי לוקמיה ראשוניים. J. Vis. Exp. (2018).

פרוטוקול זה מספק גישה ביוכימית למדידת קצב החמצה חוץ-תאי (ECAR) וקצב צריכת חמצן (OCR) של תאים לוקמיים ראשוניים עם בדיקת שטף חוץ-תאי. הערכת הפרופיל המטבולי של תאים אלה מסייעת לאפיין את דרישותיהם, מה שמוביל לטיפול מותאם אישית.

פרוטוקול

1. הכנת ריאגנטים

1. הכן 500 מ"ל של PBS על ידי המסת 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄, ב- ddH₂O. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם HCl. סטריל על ידי autoclaving.
2. הכנת 100 מ"ל של מדיום RPMI: RPMI-1640 בינוני עם L-Alanyl-Glutamine בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), פניצילין (100 U / mL) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל).
3. מכינים 50 מ"ל של 0.1 מ 'NaHCO₃ במים מזוקקים. כוונן את ה- pH ל- 8.1, סנן סטריליזציה (0.22 מיקרומטר) ואחסן ב- 4 ° C.
   הערה: עבור שני לוחות אנלייזר שטף חוץ-תאי 8 בארות, להכין 250 μL של 0.1 M NaHCO₃ pH 8.1.
4. להכין 1 מ"ל של 2 M D- גלוקוז במים מזוקקים. יש לסנן, לעקר (0.22 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
5. הכינו 100 μL של 1 mM אוליגומיצין A באתנול. יש לסנן, לעקר (0.22 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
6. הכינו 250 μL של 1 M 2-deoxy-D-glucose (2-DG) ב-DMEM מינימלי (מדיום הנשר השונה של Dulbecco). התחממו ל-37°C וכווננו את ה-pH ל-7.4 (בצעו מדידת pH ב-37°C). יש לסנן, לעקר (0.22 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
7. הכן 100 μL של 1 mM FCCP (קרבוניל ציאניד-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) ב DMSO. יש לסנן, לעקר (0.22 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
8. להכין 100 μL של 1 mM Rotenone באתנול. יש לסנן, לעקר (0.22 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
9. הכינו 100 μL של 1 מ"ג/מ"ל אנטימיצין A באתנול. יש לסנן, לעקר (0.22 מיקרומטר) ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
10. ממש לפני השימוש, להכין 10 מ"ל של מדיום בדיקת מאמץ גליקוליזה. חם DMEM מינימלי ל 37 ° C באמבט מים ולהתאים את ה- pH ל 7.4 (לבצע מדידת pH ב 37 ° C).
11. לפני השימוש, להכין 10 מ"ל של מדיום בדיקת מאמץ Cell Mito עם BSA. תוסף DMEM מינימלי עם 2 mM L-גלוטמין, 10 mM D-גלוקוז, 1 mM HEPES (pH 7.4), 1 mM pyruvate ו 0.1% BSA (אלבומין בסרום בקר). חם ל 37 ° C באמבט מים ולהתאים את ה- pH ל 7.4 (לבצע מדידת pH ב 37 ° C).
12. לפני השימוש, הכינו 10 מ"ל של מדיום בדיקת מאמץ Cell Mito ללא BSA. תוסף DMEM מינימלי עם 2 mM L-גלוטמין, 10 mM D-גלוקוז, 1 mM HEPES (pH 7.4) ו 1 mM פירובט. מדיום בדיקת מאמץ Warm Cell Mito ללא BSA עד 37°C באמבט מים וכוונן את ה- pH ל- 7.4 (בצע מדידת pH ב- 37°C).
    הערה: BSA מתווסף למדיום בדיקת המאמץ Cell Mito מכיוון שהתאים מגיבים טוב יותר ל- FCCP כאשר מוסיפים את המדיום עם BSA (נבדקו תנאים שונים). מדיום בדיקת מאמץ Cell Mito ללא BSA משמש לטעינת היציאות מכיוון שהיצרן אינו ממליץ להשתמש ב- BSA בתווך.

2. טיפוח בן לילה של תאים חד-גרעיניים

הערה: בצע את כל שלבי המשנה בתרבית רקמה סטרילית.

1. הכן שתי צלוחיות T75 עם 20 מ"ל של RPMI. לכל בקבוק, להוסיף 30 x 10⁶ תאים מונוגרעיניים מבודדים. לדגור על התאים עם בקבוק עומד במשך 16-24 שעות ב 5% CO₂ ו 37 ° C.

3. הכנת לוחות מצופים דבק תאים

1. צפו שתי צלחות אנלייזר שטף חוץ-תאי 8 בארות.
   הערה: בצעו את הציפוי בתרבית רקמה סטרילית.
2. הוסף 2.2 μL של דבק תאים (צפיפות: 2.54 מ"ג / מ"ל) ל 250 μL של 0.1 M NaHCO₃, pH 8.1, ופיפטה מיד 12.5 μL של התמיסה לתוך כל באר.
   הערה: פתרונות מלאי דבק תאים יכולים להיות שונים בצפיפותם, להתאים את נפח נוסף NaHCO₃ בהתאם.
3. תנו לצלחות לשבת במכסה המנוע במשך כ-20 דקות, ואז שאפו את דבק התא ושטפו כל באר פעמיים באמצעות 200 מיקרוליטר מים סטריליים. תן לו לשבת במכסה המנוע עם מכסה פתוח עד בארות יבשות.
4. השתמש בצלחות מיד או חסוך עד שבוע ב 4 ° C עם השפה עטוף סרט פרפין כדי למנוע עיבוי. ודאו שהצלחות מחוממות לטמפרטורת החדר (למשך כ-20 דקות) במכסה המנוע לפני זריעת התאים.

4. הידרציה של מחסנית חיישן

הערה: הידרציה שתי מחסניות מנתח שטף חוץ-תאי 8 בארות.

1. הפרד את לוחית השירות ואת מחסנית החיישן. הנח את מחסנית החיישן הפוכה על ספסל המעבדה.
2. מלא כל באר של צלחת השירות עם 200 μL calibrant. מלאו כל חפיר סביב החלק החיצוני של הבארות עם 400 μL של כיול.
3. החזר את מחסנית החיישן ללוחית השירות המכילה כעת את הכיול.
4. הניחו את מכלול המחסנית באינקובטור לח, ללא CO₂, 37°C למשך הלילה.
5. הפעל את מנתח השטף החוץ תאי ותן לו להתחמם ל 37 ° C במשך הלילה.

5. זריעה של תאים בלוחות מצופים דבק תאים

הערה: עבור בדיקת מאמץ גליקוליזה, השתמש במדיום בדיקת מאמץ גליקוליזה. עבור מבחן מאמץ Cell Mito, השתמש במדיום בדיקת המאמץ Cell Mito עם BSA.

1. תאי זרעים למבחן המאמץ גליקוליזה ולמבחן המאמץ Cell Mito בצלחות נפרדות. עבור כל בדיקה, השתמש בתאים מבקבוק אחד עם תרבית לילה.
2. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאים להשעות ב 1 מ"ל של המדיום המתאים ולספור אותם.
3. הוסף 4 x 10⁶ של תאים חיים לנפח הסופי של 400 μL (השתמש במדיום המתאים).
4. צלחת 50 μL של תרחיף התא לתוך בארות B-G. ודא ש-500,000 תאים נזרעים בבאר אחת.
   הערה: חיוני לזרוע בדיוק 500,000 תאים לבאר מכיוון שלא מתבצעת נורמליזציה אחרת. בדרך זו, ניתן להשוות את התוצאות של חולים שונים. המספר האופטימלי של עותקים משוכפלים הוא שישה, כפי שמתואר כאן. שימוש בפחות עותקים משוכפלים אינו מומלץ, מאחר שתאים ראשוניים עלולים לפעמים להתנהג בצורה שגויה.
5. הוסף 180 μL של המדיום המתאים לבארות A ו- H (בארות אלה ישמשו כתיקון רקע).
6. צנטריפוגה את הצלחת ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם בלם מוגדר 1.
7. הוסף 130 μL של מדיום מתאים לבארות B-G בשני לוחות אנלייזר שטף חוץ-תאי 8 בארות לאט ובזהירות. לאשר חזותית כי התאים דבוקים ביציבות לתחתית הבארות על ידי צפייה מתחת למיקרוסקופ.
8. הכניסו את הצלחת לאינקובטור לח, ללא CO₂, 37°C למשך 30 דקות.

6. טעינת מחסנית החיישן

1. עבור מבחן מאמץ גליקוליזה, להכין 250 μL כל אחד של 100 mM גלוקוז, 20 μM אוליגומיצין A ו 1 M 2-DG, כל בינוני מבחן מאמץ גליקוליזה.
2. לבדיקת המאמץ Cell Mito, הכינו 250 μL כל אחד של 20 μM אוליגומיצין A, 15 μM FCCP, 30 μM FCCP ותערובת של 10 μM Rotenone ו-10 מיקרוגרם/מ"ל Antimycin A, כולם במדיום בדיקת המאמץ Cell Mito ללא BSA.
   הערה: מומלץ להזריק שני ריכוזים של FCCP בבדיקה אחת מכיוון שאין מספיק חומר לחולים לטיטרציה של FCCP. עם זאת, הריכוזים צריכים להיקבע על ידי החוקר.
3. טען את התרכובות ליציאות המזרק המתאימות של המחסנית באופן הבא (טבלה 1):

7. הגדרת התוכנית

1. עבור מבחן מאמץ גליקוליזה, הגדר את התוכנית כמתואר בטבלה 2.
2. עבור מבחן המאמץ Cell Mito, הגדר את התוכנית כמתואר בטבלה 3.
3. הפעל את התוכנית. החלף את לוח הכיול בלוח הבדיקה (כאשר תתבקש לעשות זאת).

נמל	בדיקת מאמץ גליקוליזה		Cell mito stress test
	טען ליציאה	ריכוז סופי בבארות	טען ליציאה	ריכוז סופי בבארות
א	20 μL של 100 mM גלוקוז	10 מ"מ גלוקוז	20 μL של 20 מיקרומטר אוליגומיצין A	2 מיקרומטר אוליגומיצין A
ב	22 μL של 20 מיקרומטר אוליגומיצין A	2 מיקרומטר אוליגומיצין A	22 μL של 15 מיקרומטר FCCP	FCCP של 1.5 מיקרומטר
ג	25 μL של 1 M 2-DG	100 מילימטר 2-DG	25 μL של 30 מיקרומטר FCCP	FCCP של 4.5 מיקרומטר
ד	X		25 μL של 10 מיקרומטר רוטנון ו-10 מיקרוגרם/מ"ל אנטימיצין A	1 מיקרומטר רוטנון ו-1 מיקרוגרם/מ"ל אנטימיצין A

טבלה 1: נפחים מורכבים.

צעד	הגדרות
כיול	אוטומטי
שיווי משקל	אוטומטי
מדידה בסיסית	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות
הזרקת יציאה A	זריקה
מדידה	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות
הזרקת יציאה B	זריקה
מדידה	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות
הזרקת יציאה C	זריקה
מדידה	ארבע פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות

טבלה 2: תוכנית לבדיקת מאמץ גליקוליזה.

צעד	הגדרות
כיול	אוטומטי
שיווי משקל	אוטומטי
מדידה בסיסית	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות
הזרקת יציאה A	זריקה
מדידה	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות
הזרקת יציאה B	זריקה
מדידה	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות
הזרקת יציאה C	זריקה
מדידה	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות
הזרקת יציאה D	זריקה
מדידה	שלוש פעמים: מיקס – 3 דקות, המתנה – 0 דקות, מידה – 3 דקות

טבלה 3: תוכנית למבחן מאמץ Cell Mito.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מנתח סוסון ים XFp	אג'ילנט טכנולוגיות	S7802A
מיני צלחת תרבית תאים XFp סוסון ים	אג'ילנט טכנולוגיות	103025-100
קורנינג™ Cell-Tak Cell and Tissue דבק	תרמופישר סיינטיפיק	CB40240
D-(+) גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G7021-100G
אוליגומיצין A	סיגמא-אולדריץ'	75,351-5 מ"ג
2-Deoxy-D-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	D8375-1G
FCCP	סיגמא-אולדריץ'	C2920-10MG
רוטנונה	סיגמא-אולדריץ'	R8875-1G
אנטימיצין A מ Streptomyces sp.	סיגמא-אולדריץ'	A8674-25MG
סוסון ים XF בסיס בינוני, 100 מ"ל	אג'ילנט טכנולוגיות	103193-100
תמיסת L-גלוטמין, 200 מילימטר	סיגמא-אולדריץ'	G7513-100ML