יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם: שיטה ליצירת תאים דנדריטיים ממח עצם עכבר

תקציר

מקור:Nguyen, H. D., et al. פלטפורמת השתלת מח עצם לחקר תפקידם של תאים דנדריטיים במחלת השתל נגד המאכסן. J. Vis. Exp.. (2020).

סרטון זה מתאר פרוטוקול ליצירת תאים דנדריטיים - תאים מציגי אנטיגן מרכזיים המפעילים תאי T - ממח העצם של עכבר בוגר.

פרוטוקול

1. יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם (BM-DCs).

1. בודדו את מח העצם מעצם הירך והטיביאס של WT או פקטור B (fB)^-/- עכברים על רקע B6. בקצרה, לאסוף את השוקה ואת עצם הירך משתי הרגליים באמצעות מלקחיים ומספריים. שים אותם בסל"ד קר כקרח המכיל 1% FCS ו- 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ו- 2 mM L-גלוטמין (1% RPMI) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. נקו היטב את עצם הירך ואת עצמות השוקה על ידי הסרת כל רקמות השריר באמצעות מלקחיים ומספריים. מעבירים את עצם הירך ואת השוקה מצינורות חרוטי 50 מ"ל לצלחת פטרי בקוטר 92 מ"מ המכילה 1% סל"ד. בעזרת מספריים, לחתוך את הקצוות של עצם הירך או שוקה. מלא צינור 50 מ"ל עם 25 מ"ל של 1% סל"ד 1640 בינוני. השתמש בו כדי למלא מזרק 3 מ"ל המחובר למחט 26 גרם עם 3 מ"ל של 1% סל"ד. הכנס מזרק זה לתוך העצם ודחף את הבוכנה כדי לשטוף את מח העצם (BM) מתוך החלל לתוך צינור האיסוף עם 1% סל"ד (~ 3 מ"ל / עצם). סובב את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דקות.
2. להשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של ACK lysing buffer עבור ליזה של תאי דם אדומים. דוגרים על תרחיף התא למשך 5 דקות על קרח. הוסף 10 מ"ל של 1% סל"ד למתלה התא כדי לעצור את הליזיס והצנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
3. יש להשהות מחדש את כדורי התא ב-10 מ"ל של תרבית (RPMI 1640 המכיל 10% FBS, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין ו-50 mM β-מרקפטואתנול) ולהתאים את עוצמת הקול כך שתעמוד בריכוז הסופי של 2 x 10⁶ תאים/מ"ל.
4. הוסף 20 ng/mL גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה (GM-CSF) לתרחיף התא. תרביתו את תאי מח העצם בצלחות פטרי בגודל 100X15 מ"מ בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂ למשך 6 ימים.
5. החלף מחצית מהמדיה התרבית השוטפת (כ-5 מ"ל) במדיה טרייה המכילה 40 ננוגרם/מ"ל GM-CSF ביום השלישי.
6. מחממים מראש את אמצעי התרבות באמבט מים ב 37 °C (77 °F). לאסוף כ 5 מ"ל של התקשורת מן צלחת תרבית מח העצם. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת התא במדיית תרבית של 5 מ"ל המכילה 40 ננוגרם/מ"ל GM-CSF.
7. הוסף 25 מיקרוגרם / מ"ל lipopolysaccharide (LPS) למדיה ביום 6 של התרבית כדי להבשיל BM-DCs. שמור aliquot של 2 x 10⁶ תאים כדי לקבוע את יעילות התמיינות DC על ידי ציטומטריית זרימה.
8. אספו BM-DCs בוגרים: השתמשו במרימי תאים כדי לגרד ברכות DCs מצלחות הפטרי. לאסוף את כל השעיות התא ב 50 מ"ל צינורות חרוטיים. צנטריפוגה ב 800 x גרם, במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant. לשטוף את כדורי התא 3x עם 50 מ"ל של PBS קר כקרח. שמור בערך 2 x 10⁶ BM-DCs לניתוח פנוטיפ אימונולוגי על ידי ציטומטריית זרימה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10X PBS	פישר סיינטיפיק	BP3994	מאגר MACS
B6 fB-/- עכברים	אוניברסיטת מרכז פלורידה	בבית	נמענים
ב6. Ly5.1 (CD45.1 + ) עכברים	Charles נהר	546	תורמים
עכברי BALB/c	Charles נהר	28	מושתלים
C57BL/6 עכברים	Charles נהר	27	תורמים/נמענים
סרום בקר עוברי (FBS)	מערכת המו"פ של Atlanta Bilogicals	D17051	תרבית תאים
ליפופוליסכריד (LPS)	מיליפור סיגמא	L4391-1MG	DC בוגר
ניו ברונסוויק גלקסי 170R אינקובטור	אפנדורף	גלקסי 170 R	תרבית תאים
פניצילין + סטרפטומיצין פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 יחידות פניצילין / 10,000 מ"ג / מ"ל סטרפטוקו	גיבקו	15140	מדיה
RPMI 1640	Thermo Fisher Scienctific	11875-093	מדיה