יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם: שיטה ליצירת תאים דנדריטיים ממח עצם עכבר

1. יצירת תאים דנדריטיים שמקורם במח עצם (BM-DCs).

1. בודדו את מח העצם מעצם הירך והטיביאס של WT או פקטור B (fB)^-/- עכברים על רקע B6. בקצרה, לאסוף את השוקה ואת עצם הירך משתי הרגליים באמצעות מלקחיים ומספריים. שים אותם בסל"ד קר כקרח המכיל 1% FCS ו- 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין ו- 2 mM L-גלוטמין (1% RPMI) בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. נקו היטב את עצם הירך ואת עצמות השוקה על ידי הסרת כל רקמות השריר באמצעות מלקחיים ומספריים. מעבירים את עצם הירך ואת השוקה מצינורות חרוטי 50 מ"ל לצלחת פטרי בקוטר 92 מ"מ המכילה 1% סל"ד. בעזרת מספריים, לחתוך את הקצוות של עצם הירך או שוקה. מלא צינור 50 מ"ל עם 25 מ"ל של 1% סל"ד 1640 בינוני. השתמש בו כדי למלא מזרק 3 מ"ל המחובר למחט 26 גרם עם 3 מ"ל של 1% סל"ד. הכנס מזרק זה לתוך העצם ודחף את הבוכנה כדי לשטוף את מח העצם (BM) מתוך החלל לתוך צינור האיסוף עם 1% סל"ד (~ 3 מ"ל / עצם). סובב את התאים ב 800 x גרם במשך 5 דקות.
2. להשעות מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של ACK lysing buffer עבור ליזה של תאי דם אדומים. דוגרים על תרחיף התא למשך 5 דקות על קרח. הוסף 10 מ"ל של 1% סל"ד למתלה התא כדי לעצור את הליזיס והצנטריפוגה ב 800 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
3. יש להשהות מחדש את כדורי התא ב-10 מ"ל של תרבית (RPMI 1640 המכיל 10% FBS, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, 2 mM L-גלוטמין ו-50 mM β-מרקפטואתנול) ולהתאים את עוצמת הקול כך שתעמוד בריכוז הסופי של 2 x 10⁶ תאים/מ"ל.
4. הוסף 20 ng/mL גרנולוציטים-מקרופאגים-גורם מגרה מושבה (GM-CSF) לתרחיף התא. תרביתו את תאי מח העצם בצלחות פטרי בגודל 100X15 מ"מ בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂ למשך 6 ימים.
5. החלף מחצית מהמדיה התרבית השוטפת (כ-5 מ"ל) במדיה טרייה המכילה 40 ננוגרם/מ"ל GM-CSF ביום השלישי.
6. מחממים מראש את אמצעי התרבות באמבט מים ב 37 °C (77 °F). לאסוף כ 5 מ"ל של התקשורת מן צלחת תרבית מח העצם. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant. השהה מחדש את גלולת התא במדיית תרבית של 5 מ"ל המכילה 40 ננוגרם/מ"ל GM-CSF.
7. הוסף 25 מיקרוגרם / מ"ל lipopolysaccharide (LPS) למדיה ביום 6 של התרבית כדי להבשיל BM-DCs. שמור aliquot של 2 x 10⁶ תאים כדי לקבוע את יעילות התמיינות DC על ידי ציטומטריית זרימה.
8. אספו BM-DCs בוגרים: השתמשו במרימי תאים כדי לגרד ברכות DCs מצלחות הפטרי. לאסוף את כל השעיות התא ב 50 מ"ל צינורות חרוטיים. צנטריפוגה ב 800 x גרם, במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant. לשטוף את כדורי התא 3x עם 50 מ"ל של PBS קר כקרח. שמור בערך 2 x 10⁶ BM-DCs לניתוח פנוטיפ אימונולוגי על ידי ציטומטריית זרימה.