חיתוך כרומטין: שיטה ליצירת מקטעי כרומטין באמצעות עיכול אנזימטי

תקציר

מקור: Fuchs, A. R. et al. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp.(2018).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לגזירת כרומטין באמצעות עיכול אנזימטי מיקרוקוקלי נוקלאז. גזירת כרומטין היא שלב חיוני בתהליך העבודה של Chromatin immunoprecipitation או ChIp, אשר מסייע לחקור אינטראקציה חלבון-DNA בתאי לוקמיה מיאלואידית כרונית אנושית. בפרוטוקול התכונה חיתוך כרומטין מבוצע באמצעות סוניקציה.

פרוטוקול

1. קיבוע, ליזה של תאים וגזירת כרומטין

הערה: דגימות המטופל ותאי Jurkat קבועים ומועברים באמצעות ערכת ChIP זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן עם שינויים כמתואר קודם לכן. הקיבוע מתבצע תחת מכסה מנוע זרימה למינרית.

1. הכינו צינור 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של 37% פורמלדהיד, צינור 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של 1.25 מ"ל גליצין, צינור 5 מ"ל עם 4 מ"ל של 1x PBS וקופסה עם קרח לקיבוע התאים.
2. לאחר גירוי התאים לזמן הדגירה המתאים, לעורר את התאים על ידי הוספת 32.4 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) ו 1 μM ionomycin. לאחר מכן לדגור על התאים במשך 16 שעות ב 37 ° C ו 5% CO₂ עם מכסה הצינור פתוח (כדי למנוע זיהום, סרט איטום חדיר לאוויר ניתן להשתמש, לסובב את צינורות 5 מ"ל ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהשעות מחדש את התאים ב 500 μL של PBS בצינורות 5 מ"ל.
3. הוסיפו 340 מיקרומטר פורמלדהיד (13.5 מיקרוליטר של 37% פורמלדהיד) לתאים. לאחר ערבוב קצר על ידי זילוף זהיר למעלה ולמטה, לדגור על המתלה במשך 2.5 דקות (תאי Jurkat) או 5 דקות (מדגם המטופל) בטמפרטורת החדר.
   הערה: זמן קיבוע ממושך נדרש לתאים ראשוניים כדי להבטיח גזירה אופטימלית.
4. הוסף 125 mM גליצין (57 μL של 1.25 M גליצין) כדי לעצור את הקיבוע ולדגור במשך 5 דקות נוספות. שים את התאים על קרח מיד לאחר מכן צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
5. לשטוף את התאים פעמיים עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בכל פעם על ידי שאיפה.
   הערה: לאחר הקיבוע, ניתן להשהות את הפרוטוקול. תאים קבועים צריכים להיות מאוחסנים ב -80 °C. כדי לבדוק, אם האפיטופ של הנוגדן המיועד לשימוש בפרוטוקול הבא אינו מוסווה באמצעות קיבוע, ניתן להשתמש בדגימות נוספות לניתוח באמצעות אלקטרופורזה בג'ל SDS-PAGE וכתם מערבי. שלבים אלה מבוצעים עם 100 מיקרוגרם חלבון בהתאם להוראות היצרן. כל נוגדני αNFAT2 משמשים בדילול של 1:1000, נוגדן GAPDH בדילול של 1:10000. תמונה לדוגמה של דגימות קבועות מתאי Jurkat עם נוגדנים מתאימים ולא מתאימים מוצגת באיור 1.
6. השהה מחדש את גלולת התא ב -5 מ"ל של חיץ ליזיס זמין מסחרית 1 על ידי פיפטציה למעלה ולמטה. לאחר מכן, הניחו את הדגימות על הקרח על שייקר ודגרו עליהן במשך 10 דקות תוך כדי ניעור.
   הערה: לפני הליזה, התאים יכולים להתפרק במשך 10 שניות בחנקן נוזלי. זה שימושי עבור תאי Jurkat אבל יש להימנע בדגימות ראשוניות של המטופל. עבור התפרקות, מניחים את צינורות 5 מ"ל עבור 5 s ב 5-10 מ"ל של חנקן נוזלי במיכל מסוים. יש להרכיב משקפי בטיחות וכפפות בטיחות מתאימות.
7. לאחר מכן, צנטריפוגות את הצינורות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות על ידי pipetting.
8. הומוגניזציה של התאים ב 5 מ"ל של חיץ ליזה זמין מסחרית 2 על ידי pipeting למעלה ולמטה לדגור במשך 10 דקות על קרח תוך רעיד. לאחר מכן צנטריפוגו את הצינורות ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות על ידי pipetting.
9. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-500 μL (תאי Jurkat) או 140 μL (דגימות מטופלים) של חיץ גזירה 1 המכיל מעכב פרוטאז 1x (5 μL או 1.4 μL, בהתאמה) ולדגור על התערובת במשך 10 דקות על קרח.
10. עבור גזירת כרומטין, העבר 140 μL של תרחיף התא משלב 1.9 לתוך צינורות סוניקטור (הימנע מייצור בועות אוויר וחזור על שלב זה במידת הצורך עקב נפח הדגימה). הניחו את הצינורות באולטרה-סוניקטור הממוקד בטמפרטורה של 7 מעלות צלזיוס וגזירה במשך 10 דקות (קו התא) או 7.5 דקות (דגימות מטופלים) עם עוצמת אירוע ממוצעת של 9.375 W כדי לקבל מקטעי DNA של 200-500 bp.
11. לבסוף, צנטריפוגה ב 15700 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C בצנטריפוגה קטנה לאסוף את supernatant בצינור חדש 1.5 מ"ל.
12. כדי לבדוק את גדלי המקטעים המתאימים, נתח 20 μL של הכרומטין הגזור באמצעות אלקטרופורזה ג'ל בג'ל אגרוז TBE 1.5%. תמונה לדוגמה של כרומטין גזוז מתאי Jurkat באיכות טובה ורעה, מוצגת באיור 2. בשלב זה, ניתן להשהות את הפרוטוקול. כרומטין גזוז צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C.

תוצאות

איור 1: דוגמאות לביצועי נוגדנים בתאי Jurkat קבועים שהוערכו על-ידי SDS-PAGE ו-Western-Blot. (a) תאי Jurkat תוקנו למשך 0 דקות (פסים A ו-D), 2.5 דקות (פסים B ו-E), או 5 דקות (C ו-F) והושוו נוגדני NFAT2 α(שיבוט 7A6) מיצרנים שונים (רצועות A-C = יצרן 1, רצועות D-F = יצרן 2). הנוגדן של יצרן 1 הראה ביצועים כלליים טובים יותר, ונקשר עם הזיקה הגבוהה יותר אפילו לדגימות קב...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
37% פורמלדהיד p.a., ACS	רוט	4979.1
1 X PBS	סיגמא אולדריץ'	D8537
1.5 מ"ל שייקר צינור נוחות Themomixer	אפנדורף	5355 000.011	ניתן להחליף במכשירים דומים
M220 ממוקד-אולטרה-סאונד	קובאריס	500295
20X Bolt MES SDS מאגר ריצה	תרמו סיינטיפיק	B0002
תריס מלח חוצץ (TBS-10X)	איתות סלולרי	#12498
מכשיר iBlot 2 להעברת ג'ל	תרמו סיינטיפיק	IB21001
iBlot 2 ערימות העברה, ניטרוצלולוז, גודל רגיל	תרמו סיינטיפיק	B23001
צנטריפוגה גדולה	אפנדורף	5804R	ניתן להחליף במכשירים דומים
DNA LoBind Tube 1.5 מ"ל	אפנדורף	22431021
קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז (100X)	תרמו סיינטיפיק	78440
צנטריפוגה קטנה	תרמו סיינטיפיק	הראוס פרסקו 17
ביוקול מדיום שיפוע צפיפות (צפיפות 1,077 גרם/מ"ל)	מרק	L 6115