בדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין: טכניקה לחקר אינטראקציות חלבון-דנ"א בתאים

תקציר

מקור: Fuchs, A. R., et al. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מתאר פרוטוקול לבדיקת משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP), שהיא טכניקה קלאסית להדגמת אינטראקציות חלבון-דנ"א. טכניקה זו משמשת לזיהוי גני מטרה בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית בבני אדם.

פרוטוקול

1. כרומטין משקעים חיסוניים

הערה: המשקעים החיסוניים של הכרומטין בוצעו עם ערכת ChIP זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן עם שינויים.

1. חשב את מספר המשקעים החיסוניים (70 μL (תאי Jurkat) או 15 μL (דגימות חולה) של כרומטין גזוז בתוספת נוגדן אחד) והכן 20 μL של חלבון A חרוזים מצופים לכל משקעים בצינור 1.5 מ"ל. שטפו את החרוזים ב-40 מיקרוליטר של 1x חיץ ChIP 1 לכל משקעים על ידי פיפטציה למעלה ולמטה, תנו לחרוזים לנוח במדף מגנטי למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנאטנט על ידי פיפטנט. בצע שלב זה ארבע פעמים בסך הכל. בסופו של דבר, השהה מחדש את החרוזים בנפח המקורי עם 1x ChIP buffer 1.
2. עבור המשקעים החיסוניים עצמם, השתמש ב- 10 מיקרוגרם של נוגדן αNFAT2 (7A6) כדי ללכוד NFAT2 עם רצפי המטרה המאוגדים שלו. השתמש 2.5 מיקרוגרם של נוגדן IgG ארנב (DA1E) כמו בקרת IgG. הכן את התגובות בצינורות טריים של 1.5 מ"ל כמצוין בטבלה 1.
   הערה: חשוב להשתמש בנוגדן חד שבטי בעל זיקה גבוהה שהאפיטופ שלו אינו מוסווה במהלך הקיבוע לפרוטוקול זה. נוגדנים רב-שבטיים מציגים רמה נוספת של וריאציה, מה שמקשה באופן משמעותי על פירוש נכון של התוצאות שהתקבלו.
3. יש לדגור על התערובת משלב 1.2 למשך הלילה ב-4°C על גלגל מסתובב ב-6 סל"ד.
4. למחרת סובבו את הצינורות במשך 5 שניות במהירות של 7,000 x גרם בצנטריפוגה הקטנה, דגרו עליהם במדף מגנטי למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנאטנט על ידי שאיפה. שטפו את החרוזים פעם אחת עם כל אחד ממאגרי הכביסה 1, 2, 3 ו-4 ברצף.
5. כדי לעשות זאת, להשהות מחדש את החרוזים ב 350 μL של חיץ כביסה לדגור אותם במשך 5 דקות ב 4 ° C על גלגל מסתובב ב 6 סל"ד.
6. לאחר מכן, סובבו את הצינורות במשך 5 שניות ב 7000 x גרם בצנטריפוגה הקטנה. לאחר מכן, הניחו אותם למשך דקה אחת במדף מגנטי, הסירו את הסופרנאטנט והוסיפו את מאגר הכביסה הבא.
7. לאחר שלב השטיפה האחרון, מוציאים את הסופרנאטנט על ידי פיפטציה, לוקחים את החרוזים ב-100 מיקרוליטר של חיץ אלוציה 1 ודגרים עליהם במשך 30 דקות על גלגל מסתובב ב-6 סל"ד.
8. סובבו את הצינורות תוך זמן קצר (5 שניות ב-7000 x גרם בצנטריפוגה הקטנה) והניחו אותם במדף מגנטי למשך דקה אחת.
9. לאחר מכן להעביר את supernatant על ידי pipetting לצינור חדש 1.5 מ"ל ולהוסיף 4 μL של חיץ elution 2.
10. כדי ליצור את בקרת הקלט, ערבב 1 μL של הכרומטין החתוך עם 99 μL של חיץ אלוציה 1 ו- 4 μL של חיץ אלוציה 2 (בהגדרה זו, ישנם שלושה צינורות לכל מטופל: בקרת קלט אחת, בקרת IgG אחת ודגימה אחת αNFAT2).
11. יש לדגור על הדגימות במשך 4 שעות ב-65°C וב-1300 סל"ד בשייקר צינור בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 100 μL של 100% איזופרופנול, מערבולת וסובב את הדגימות במשך 5 שניות ב 7000 x גרם בצנטריפוגה הקטנה.
12. השהה מחדש את החרוזים המגנטיים הזמינים על ידי ערבול יסודי, הוסף 10 μL של החרוזים לכל דגימה ודגר במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב ב -6 סל"ד.
13. לאחר הדגירה, סובבו את הצינורות במשך 5 שניות ב 7000 x גרם בצנטריפוגה הקטנה והניחו אותם במשך דקה אחת במדף מגנטי. הסר את הסופרנאטנט על ידי שאיפה.
14. להשעות מחדש את החרוזים ב 100 μL של חיץ כביסה 1. הפכו את הצינורות כדי לערבב ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב ב-6 סל"ד.
15. סובבו את הצינורות במשך 5 שניות במהירות של 7000 x גרם בצנטריפוגה הקטנה, הניחו אותם למשך דקה אחת במדף מגנטי והוציאו את הסופרנאטנט על ידי פיפטציה. חזור על השלבים 2.13-2.14 עם מאגר כביסה 2.
16. לאחר מכן, להסיר את חיץ הכביסה על ידי שאיפה, להשעות מחדש את החרוזים ב 55 μL של חיץ elution לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר על הגלגל מסתובב ב 6 סל"ד כדי לנטרל את ה- DNA המואץ. לבסוף, סובבו את הצינורות במשך 5 שניות ב 7000 x גרם בצנטריפוגה הקטנה, הניחו אותם למשך דקה אחת במדף מגנטי והעבירו את הסופרנאטנט לצינורות חדשים של 1.5 מ"ל.
    הערה: כאן ניתן להשהות את הפרוטוקול. לאחר מכן יש לאחסן את הדנ"א המדולל בטמפרטורה של -20°C.

פריט	נפח (μL) לכל IP
5% BSA	6
100 x מעכב פרוטאז	3
5 x מאגר ChIP 1	56
כרומטין גזוז	x (15 מיקרוליטר או 70 מיקרוליטר)
חלבון A חרוזים מגנטיים מצופים	20
ChIP seq כיתה מים	185-x-y
נוגדנים (αNFAT2 או IgG-control)	y (1.09 מיקרוליטר או 1 מיקרוליטר)
סך	270

טבלה 1: לוח זמנים לפיפטציה של המשקעים החיסוניים של הכרומטין. המשקעים החיסוניים של הכרומטין בוצעו על ידי הכנת התגובות כפי שמצוין בטבלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן נגד NFAT2	אלקסיס	1008505	שיבוט 7A6
נוגדן נגד NFAT2	איתות סלולרי	8032S	שיבוט D15F1
נוגדן Anti-NFAT2 בדרגת ChIP	אבקאם	dorit_1996	שיבוט 7A6
ארון תקשורת מגנטי, מגנט DynaMag-15	תרמו סיינטיפיק	12301ד	ניתן להחליף במכשירים דומים
ערכת iDeal ChIp-seq עבור Histones	דיאגנודה	C01010059
צנטריפוגה קטנה	תרמו סיינטיפיק	הראוס פרסקו 17	ניתן להחליף במכשירים דומים
שייקר דואומקס 1030	היידולף אינסטרומנטס	543-32205-00	ניתן להחליף במכשירים דומים
קוקטייל מעכבי פרוטאז ופוספטאז (100X)	תרמו סיינטיפיק	78440
IRDye 680LT חמור נגד ארנב IgG (H + L), 0.5 מ"ג	LI-COR Biosciences	926-68023
IRDye 800CW עיזים נגד עכבר IgG (H + L), 0.1 מ"ג	LI-COR Biosciences	925-32210
DNA LoBind Tube 1.5 מ"ל	אפנדורף	22431021
FBS מעולה	מרק	S0615
37% פורמלדהיד p.a., ACS	רוט	4979.1
1 X PBS	סיגמא אולדריץ'	D8537
M220 ממוקד-אולטרה-סאונד	קובאריס	500295
20X Bolt MES SDS מאגר ריצה	תרמו סיינטיפיק	B0002
תריס מלח חוצץ (TBS-10X)	איתות סלולרי	#12498
מכשיר iBlot 2 להעברת ג'ל	תרמו סיינטיפיק	IB21001
iBlot 2 ערימות העברה, ניטרוצלולוז, גודל רגיל	תרמו סיינטיפיק	B23001
צנטריפוגה גדולה	אפנדורף	5804R	ניתן להחליף במכשירים דומים