גידול וקציר של שיבוטים HSPC: שיטה להשגת שיבוטים HSPC ממוינים יחיד

תקציר

מקור: Huber, A. R., et al. אפיון עומס מוטציוני והרכב שיבוט של דם אנושי. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון וידאו זה מתאר את הפרוטוקול לבידוד HSPCs ממח העצם ומייונם באמצעות טכניקת מיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים, שהיא שיטה להשגת HSPCs ממוינים יחידים. אנו מגדלים תאים ממוינים אלה כדי להשיג שיבוטים של HSPC.

פרוטוקול

1. בידוד, מיון ותרבות HSPC

1. יש לסחרר כלפי מטה במהירות של 1-2 x 10⁷ תאים חד-גרעיניים למשך 5 דקות ב-350 x גרם ולהשהות מחדש במאגר FACS של 50 מיקרוליטר. השהה מחדש את גלולת התא ב 100 μL של תמיסת צביעה נגד CD3 (דילול 1:100 של נוגדן אנטי CD במאגר FACS). העברת התאים לצינור מיקרוצנטריפוגה.
   הערה: בעת מיון עם >2 x 10⁷ תאים, הגדל את תמהיל הנוגדנים ואת נפחי חיץ FACS בהתאם.
2. הכינו 50 מיקרוליטר של תערובת צביעה 2x HSC בהתאם למתכון שניתן לראות בטבלה 1
3. ערבבו 50 מיקרוליטר של תמיסת תאים עם תערובת צביעת HSC מוכנה ודגרו על התאים במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) או במשך שעה על קרח כדי שהנוגדנים ייקשרו.
4. לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ FACS גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 350 x גרם.
5. השהה מחדש את התאים במאגר FACS של 300 מיקרוליטר וסנן את תרחיף התא דרך צינור פוליסטירן של 5 מ"ל במסננת תאים בגודל 35 מיקרומטר כדי להסיר גושי תאים לפני מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS).
6. הכן 25 מ"ל של מדיום תרבית HSPC, המורכב ממדיום SFEM 1x בתוספת SCF של 100 ננוגרם/מ"ל, 100 נ"ג/מ"ל Flt3, 50 נ"ג/מ"ל TPO, 10 נ"ג/מ"ל IL-3, 20 נ"ג/מ"ל IL- 6 ו-100 נ"ג/מ"ל נוסחה אנטיביוטית (ראה טבלת חומרים).
7. מלא צלחת תרבית תאים 384 באר עם 75 μL של מדיום תרבית HSPC בכל באר.
   הערה: כדי למנוע אידוי של התווך בבארות החיצוניות, מלא את הבארות החיצוניות ב- 75 מיקרוליטר מים סטריליים או PBS, ואל תשתמש בבארות אלה למיון תאים.
8. מיון HSPCs בודדים
   1. הגדר שערים למיון HSPC בהתבסס על בקרה לא מוכתמת (HSCs ממוינים ביחידות) ו- 10,000 תאים מהדגימה המוכתמת. תוצאה מייצגת להצבת שערים מתוארת באיור 1. שער תאים בודדים על-ידי ציור שער סביב המקטע ליניארי בגובה FSC לעומת שבר שטח FSC. השתמש בשבר בקרה לא מוכתם כדי לצייר שער ^לשבר שושלת. צייר שערים עבור תאי CD34⁺ ואפיין עוד יותר קבוצת משנה זו על ידי הגדרת שער ספציפי עבור תאי CD38^- CD45RA.
   2. טען את צלחת הבאר 384 במכשיר FACS ומיין תאים בודדים.
      הערה: אם רלוונטי ל- FACS-machine, הפעל את האפשרות לשמור נתוני מיון אינדקס כדי לאפשר מעקב מחדש אחר התאים הממוינים.
9. טיפוח HSCs ממוינים באופן יחיד
   1. להעביר ישירות את צלחת באר 384 לח 37 ° C אינקובטור עם 5% CO₂.
      הערה: כדי למנוע אידוי במהלך התרבית, עטפו את צלחת תרבית 384 הבארות (עם מכסה) בניילון פוליאתילן שקוף.
   2. שמור את צלחת באר 384 באינקובטור במשך 3-4 שבועות עד שמופיעים שיבוטים גלויים. תמונות מייצגות של תרבות השבטים מתוארות באיור 2. בהתבסס על מצב חומר הקלט, 5%-30% מהתאים הממוינים יתרחבו באופן קלוני.

נוגדן	נפח [μL]
BV421-CD34	5
תערובת FITC-Lineage (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	2
APC- CD90	0.5
PerCP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
FITC -CD16	1
FITC-CD11	5
מאגר FACS	25.5

טבלה 1: תערובת מיון HSC.מוצגת טבלה המציינת את דילול הנוגדנים המשמשים למיון HSCs.

2. קצירת שיבוטים של HSPC

1. לאחר 4 שבועות של תרבית, לקבוע אילו בארות יש מפגש של 30% או יותר.
2. למלא מראש (עבור כל גידול משובט) 1.5 מ"ל microtubes עם 1 מ"ל של 1% BSA ב PBS ולתייג את הצינור על פי הבאר המתאימה.
3. הרטיבו מראש קצה פיפטה עם 1% BSA ב-PBS כדי למזער את מספר התאים שנדבקים לקצה הפיפטה.
4. מעלים / מורידים את התווך בבאר בעוז (לפחות 5 פעמים) עם פיפטה של 200 μL (נקבעים על 75 μL) ומגרדים את תחתית הבאר כדי לשחרר תאים בבאר, ואוספים את תרחיף התא במיקרו-צינור המסומן המתאים לבאר.
5. קח 75 μL של 1% BSA טרי ב- PBS וחזור על פיפטינג בבאר כדי להבטיח ספיגה מקסימלית של תאים.
   הערה: תאים בתרבית קלונלית יכולים להידבק לתחתית הבאר. בדוק את הבארות באמצעות מיקרוסקופ אור הפוך סטנדרטי כדי לוודא אם כל התאים נאספו.
6. אם כל הבארות עם >30% מפגש כבר נקצרו, להחזיר את צלחת 384 באינקובטור. תרביות שבטים יכולות להתרבות עד 5 שבועות.
7. סובב את מתלה התא למשך 5 דקות במהירות של 350 x גרם. גלולה קטנה צריכה להיות גלויה.
8. בזהירות להסיר את כל מלבד כ 5 μL של supernatant. ניתן להקפיא כדוריות תאים בטמפרטורה של -20°C ולאחסן אותן במשך חודשים רבים לפני בידוד DNA.

תוצאות

איור 1: תרשים זרימה המתאר הליך ניסויי המבוסס על חומר קלט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: אסטרטגיית מיון תאים.ראשית, gating מבוצע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
CD11c FITC	ביולג'נד	301603	שיבוט 3.9
CD16 FITC	ביולג'נד	302005	שיבוט 3G8
CD3 BV650	ביולג'נד	300467	שיבוט UCHT1
CD34 BV421	ביולג'נד	343609	561
CD38 PE	ביולג'נד	303505	שיבוט HIT2
CD45RA PerCP/Cy5.5	ביולג'נד	304121	שיבוט HI100
CD49f PE/Cy7	ביולג'נד	313621	שיבוט GoH3
נגמ"ש CD90	ביולג'נד	328113	שיבוט 5E10
מסננת תאים 5 מ"ל צינור	קורנינג	352235
צלחת CELLSTAR, 384W, 130 μL, F-תחתית, TC, כיסוי	גריינר	781182
Human Flt3-Ligand, באיכות פרימיום	Miltenyi ביוטק	130-096-479	Reconsititute ב aliquots חד פעמי (25 μL) ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.1% BSA ב PBS
רקומביננטי אנושי IL-3 (E. coli-expressed)	טכנולוגיות תאי גזע	78040.1	Reconsititute ב aliquots חד פעמי (2.5 μL) ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.1% BSA ב PBS
רקומביננטי אנושי IL-6 (E. coliexpressed)	טכנולוגיות תאי גזע	78050.1	Reconsititute ב aliquots חד פעמי (5 μL) ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.1% BSA ב PBS
SCF אנושי, באיכות פרימיום	Miltenyi ביוטק	130-096-695	Reconsititute ב aliquots חד פעמי (25 μL) ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.1% BSA ב PBS
TPO אנושי, ברמת פרימיום	Miltenyi ביוטק	130-095-752	Reconsititute ב aliquots חד פעמי (12.5 μL) ב 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.1% BSA ב PBS
שושלת יוחסין (CD3/14/19/20/56) FITC	ביולג'נד	348701	שיבוטים: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
PBS			מיוצר במתקן המכון. PBS זמין מסחרית ניתן להשתמש גם
פרימוצין	אינוויווגן	ANT-PM-1	פורמולציה אנטיביוטית