$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
בידוד תאי c-Kit+ ממח עצם
- להקריב את העכברים על פי הנחיות מוסדיות.
הערה: כאן, העכברים נחשפו לפחמן דו חמצני (CO2) בקצב זרימה המומלץ על ידי AVMA עד שהמוות נקבע על ידי הפסקת הנשימה ודופק הלב, ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.
- קצרו את עצמות הרגליים מהעכבר – שתי עצם הירך, שתי טיביאס, שתי איליאקות. נקה את כל הרקמות מהעצמות על ידי גירוד עם אזמל. שים את עצמות הרגליים בקור 1x PBS על קרח - 5 מ"ל בצינור 15 מ"ל. יוצקים את תכולת הצינור למכתש ומועכים אותו עם מזיק.
- סנן את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור מכסה בורג של 50 מ"ל עם פיפטה של 10 מ"ל מחוברת, באמצעות פיפטה. שטפו את הטיט והמזיק מספר פעמים עם PBS 1x קר, אספו והוסיפו תרחיף תאים לצינור 50 מ"ל. סובבו את מח העצם כלפי מטה במהירות של 1,200 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות. מוציאים את הסופרנאטנט דרך ואקום עם פיפטה מזכוכית מחוברת. להשעות את גלולת התא ב 5 מ"ל של 1x PBS עם פיפטה.
- עם פיפטה, לאט להוסיף מוח עצם מושעה לחלק העליון של 5 מ"ל של טמפרטורת החדר (הטמפרטורה היא קריטית) פוליסוכרוז, תוך הקפדה רבה לא להפריע לממשק. סובב במהירות של 400 x גרם בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות כשהבלם כבוי.
- אסוף את ממשק התא המונו-גרעיני הכולל המעונן (TMNC) עם פיפטה והכנס אותו לצינור חדש של 15 מ"ל. הביאו את הנפח עד 10 מ"ל עם 1x PBS לכביסה, תוך לקיחת 20 μL לספירה, וסחררו ב-1,200 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט ושמרו את הגלולה על קרח לשלב 4.6.1.
- בצעו בידוד תאי c-Kit+.
- עקוב אחר פרוטוקול ערכת מיקרו-חרוזים לבידוד תאי c-Kit+. להשעות מחדש את גלולת התא ב 80 μL של 1x PBS + EDTA + BSA ל 107 תאים. לתרחיף התא, הוסף 20 μL של CD117 MicroBeads/107 תאים בסך הכל. מערבבים היטב על ידי ערבול ודגרים במשך 10 דקות ב-4°C. מביאים את עוצמת הקול ל-10 מ"ל על ידי הוספת 1x PBS + EDTA + BSA וסחררו ב-1,200 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות.
- הסר את הסופרנאטנט באמצעות ואקום והשהה את גלולת התא ב 500 μL / 108 תאים סה"כ ב 1x PBS + EDTA + BSA. באמצעות מעמד המגנט עם העמוד המגנטי מחובר, הוסף 3 מ"ל של 1x PBS + EDTA + BSA ואפשר לו לזרום דרך כוח הכבידה לתוך צינור איסוף של 15 מ"ל.
- לאחר שתוספת החיץ הראשונה סיימה לעבור דרך העמודה, הוסף את מתלה התא לעמודה, ואפשר לו לזרום דרך כוח הכבידה לתוך צינור האיסוף של 15 מ"ל. זרימה זו היא מקטע התא הבלתי רצוי.
- שטפו את העמוד 3 פעמים עם 3 מ"ל 1x PBS + EDTA + BSA בכל פעם, מה שמאפשר לו לזרום דרך כוח הכבידה לתוך צינור האיסוף. הסר את העמוד מהמגנט והנח על החלק העליון של צינור 15 מ"ל.
- הוסף 5 מ"ל של 1x PBS + EDTA + BSA ומיד לשטוף אותו עם הבוכנה שסופקה עם העמודה. הסר את הבוכנה וחזור על ההדחה עם 5 מ"ל נוספים של 1x PBS + EDTA + BSA. ספירת התאים באמצעי האחסון הכולל באמצעות שיטות סטנדרטיות.
- סובב את התאים כלפי מטה ב- 1,200 x גרם ב- 4 ° צלזיוס למשך 5 דקות. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש את הגלולה ב- IMDM מלא (IMDM + 10% FBS + IL-6 [10 ng/mL] + mSCF [50 ng/mL] + ליגנד FLT3 [20 ng/mL] + IL-3 [10 ng/mL]) לתרבית. תרבית תאים אלה בן לילה ב 2 x 106 תאים / 1 מ"ל של IMDM התא להשלים מדיה על ידי הצבתם באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2.