התמרה בתיווך רטרו-ויראלי: שיטה להחדרת גן מטרה לתאים סרטניים

תקציר

מקור: Kesarwani, M., et al. Methods for Assessment the role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לאימות גנטי על ידי העברת גני מטרה באמצעות רטרו-וירוסים בשורות תאי לוקמיה מיאלואידית כרונית. הרטרו-וירוסים פועלים כמתווך להעברת חומר גנטי לתא הלוקמיה בתהליך הנקרא טרנסדוקציה, המאפשר ביטוי ארוך טווח של גן המטרה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל תאי המטרה לצורך אימות גנטי ופיתוח טיפולי.

פרוטוקול

1. התמרה

1. טרנספקציה פלסמיד רטרו-ויראלי
   1. הפשירו טרי תאי HEK293 אחר הצהריים הקודם באמבט מים המוגדר ל -37 מעלות צלזיוס. סובבו את צינור ההקפאה המכיל את תאי HEK ב 435 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. הסר את הסופרנאטנט באמצעות ואקום והשהה את גלולת התא ב -1 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS, פניצילין, סטרפטומיצין וגלוטמין.
   2. ספרו את התאים והוסיפו את הנפח המתאים לצלחת מטופלת בקוטר 10 ס"מ (~ 4 x 10⁶ HEK293T תאים). הוסף 14 מ"ל של מדיה DMEM 10 לצלחת ולערבב אותו היטב על ידי החלקה למעלה ולמטה לחלוקה שווה. מניחים את המנה באינקובטור של 37°C, 5% CO₂ למשך הלילה.
   3. למחרת בבוקר, בדוק את מפגש התאים תחת מיקרוסקופ אור הפוך (50% או יותר עובד טוב).
   4. שלב את ה- DNA (פלסמיד רטרו-ויראלי רצוי), PclEco (פלסמיד אריזה), 2 M CaCl₂ ו- H₂0 בצינור של 1.5 מ"ל (= 500 μL) באמצעות מיקרופיפטה בכמויות הבאות: 7.5 מיקרוגרם DNA (BCR-ABL1-YFP), 7.5 מיקרוגרם pCLeco, 62 μL של 2 M CaCl₂, ומים לנפח סופי של 500 μL. הוסף 500 μL של 2x HBS לצינור נוסף של 1.5 מ"ל
   .
   5. יש להוסיף את תערובת הדנ"א לצינור בנפח 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של 2x HBS (280 mM NaCl, 100 mM HEPES ו-1.5 mM Na₂HPO₄) בזמן הערבוב. השג זאת על ידי הגדרת מערבולת למהירות הנמוכה ביותר והחזק עליה את צינור HBS לערבוב קבוע תוך הוספת תערובת הטרנספקציה.
   6. מניחים לתערובת הטרנספקציה לדגור במשך 20-30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה מוסיפים 25 ננומטר כלורוקין לתאי HEK ומחזירים אותם לאינקובטור. לאחר הדגירה, מוסיפים את תערובת הטרנספקציה טיפתית לתאי HEK ולאחר מכן, מערבלים בעדינות את המדיה כדי לערבב את תערובת הטרנספקציה בכל הצלחת.
   7. לדגור על התאים עם תערובת במשך ~ 8 שעות באינקובטור 37 ° C, 5% CO₂. שנה את המדיה על תאים אלה על ידי הוספה איטית מאוד של 14 מ"ל של מדיה DMEM 10 טרי. הצמדה איטית לדופן הצלחת מסייעת למנוע הפשטה של תאי ה-HEK. לדגור את התאים לילה ב 37 ° C, 5% CO₂ אינקובטור.
   8. אספו את הסופרנאטנט הנגיפי עם מזרק 10 מ"ל, משכו את הסופרנאטנט לתוך המזרק וחברו את מסנן המזרק 0.45 מיקרומטר. צללו את הסופרנאטנט הנגיפי לתוך צינור איסוף חדש. קח את האוסף הראשון של supernatant ויראלי ~ 16 שעות מאוחר יותר.
2. פיברונקטין ריכוז נגיפי והתמרה
   1. הוסף 2 מ"ל של מקטע פיברונקטין אנושי רקומביננטי 0.1 מ"ג ב- 1x PBS לצלחות תרבית 6 בארות לא מטופלות. הכינו כמה פיברונקטין לפי הצורך, אשר תלוי במספר התאים והגנוטיפים. באר אחת יכולה להתמיר מספיק 10 מיליון תאי c-Kit+. לדגור את הצלחת לילה ב 4 °C (75 °F).
   2. למחרת, להסיר את פיברונקטין מן הבארות עם פיפטה, פיפטה 2 מ"ל של סטרילי 2% BSA ב 1x PBS לחסום את הצלחת, ולדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את ה- BSA באמצעות שואב אבק ושטוף היטב על ידי פיפטציה של 2 מ"ל של PBS 1x ולאחר מכן הסר אותו באמצעות ואקום.
   3. יש להוסיף מיד סופרנאטנט נגיפי טרי שנאסף ומסונן (ב-0.45 מיקרומטר) עד 5 מ"ל. צנטריפוגה ב 435 x גרם ב 32 ° C במשך 2 שעות. הסר את הסופרנאטנט דרך ואקום וחזור על שלב זה עם סופרנאטנט ויראלי טרי נוסף שנאסף וסחרר שוב. הסר את supernatant באמצעות ואקום לשטוף את הבארות על ידי הוספת 2 מ"ל של 1x PBS; לאחר מכן, הסר אותו באמצעות ואקום.
   4. הוסף את תאי העכבר c-Kit+ שגודלו בתרבית בן לילה על ידי סיבוב התאים והשעיה מחדש של הגלולה ב- IMDM מלא, לתרבית. תרבית תאים אלה בן לילה ב 2 x 10⁶ תאים / 1 מ"ל של IMDM התא להשלים מדיה על ידי הצבתם באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO₂) לבארות מצופות ויראלי על ידי ערבוב היטב את מתלי התא ו pipeting אותם לתוך צלחת פיברונקטין מרוכז ויראלי עכשיו. סחור ב-1,200 x גרם ב-25°C למשך 90 דקות. שים את התאים 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור.
   5. 48 שעות לאחר הטרנסדוקציה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 1,200 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות להשעות אותם מחדש במאגר FACS #1 (1x PBS + 0.5% BSA) ל 6 x 10⁶/מ"ל. קבע את אחוז התאים החיוביים BCR-ABL1 על-ידי מדידת אחוז YFP חיובי באמצעות ציטומטריית זרימה.
   6. רכוש אירועים עם ההליך הסטנדרטי. ראשית, שער התאים החיים בהתבסס על פיזור קדימה וצדדית. לאחר מכן, שער את התאים החיים החיוביים של YFP למעט התאים השליליים של YFP שנקבעו על-ידי בקרה שלילית (איור 1).

תוצאות

איור 1: FACS מראה את התדירות של תאי YFP+ מדמם של עכבר מושתל ועכבר WT (ביקורת שלילית). הלוחות העליונים מציגים תרשים פיזור של התאים והגטינג. הלוחות התחתונים מציגים היסטוגרמות של פיזור YFP לעומת פיזור צד. תאים עם MFI של >10³ נחשבו YFP+. גטינג דומה שימש לתאי מח עצם לאחר התמרה לצורך חישוב אחוז הטרנסדוקציה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
DMEM	Cellgro (קורנינג)	15-013-CV
רטרונקטין רקומביננטי מקטע פיברונקטין אנושי	טאקרה	T100B
פ.ב.ס.	אטלנטה ביולוגית	S11150
פן/סטרפ	Cellgro (קורנינג)	30-002-CI
ל-גלוטמין	Cellgro (קורנינג)	25-005-CL	5 מ"ג/מ"ל מלאי במים
HEPES	סיגמא	H7006
PBS	קורנינג	21040CV
Na2HPO4.7H2O	סיגמא	S9390
סידן כלורי	Invitrogen	K278001
2x HBS	Invitrogen	K278002
EDTA	אמביון	AM9261
BSA	סיגמא	A7906
תרבית אנושית ארוכת טווח יוזמת בדיקת תאים	טכנולוגיות תאי Stemp
מונה תאים אוטומטי TC-10	ביו-ראד
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	תוצרת בית
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	תוצרת בית
ROSACreERT2	מעבדת ג'קסון
C57Bl/6	מעבדת ג'קסון
CML-CD34+ ותאי CD34+ רגילים	בית חולים אוניברסיטאי, אוניברסיטת סינסינטי
LSR II (מנתח FACS)	ב.ד.
Fortessa I (מנתח FACS)	ב.ד.
FACSAriaII (סדרן FACS)	ב.ד.
חממת CO2 סדרת NAPCO 8000 WJ	תרמו-מדעי
סווינג דלי רוטור cetrifuge 5810R	אפנדורף
1/2 סמ"ק Lo-Dose U-100 מזרק אינסולין 28 G1/2	בקטון דיקינסון	בקטון דיקינסון
הידרוקורטיזון נתרן המיסוקצינאט	טכנולוגיות תאי גזע	7904
GM-CSF	פרוספקט	CYT-221
G-SCF	פרוספקט	CYT-220
IL-3 אנושי	פרוספקט	CYT-210
SCF אנושי	פרוספקט	CYT-255
אריתרופויין	אמג'ן	5513-267-10
BD Perm/Wash (חלחול ותמיסת שטיפה לזרימת זרחן)	ב.ד.	554723
BD Cytofix/Cytoperm (תמיסת תיקון וחדירה)	ב.ד.	554714
BD פארם ליז	ב.ד.	555899
70 מיקרומטר כוכב תא ניילון	בקטון דיקינסון	352350
מסנן אקרו דיסק 0.45 מיקרומטר	פאל	2016-10