מאמר שיטה

בדיקת CFU מבוססת מתיל תאית: שיטה לקביעת ההשפעה של תרכובות אנטי-סרטניות על היווצרות מושבות בתאים לוקמיים

30 באפריל 2023

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Kesarwani, M., et al. Methods for Assessment the role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול של יחידת היווצרות מושבה מבוססת מתיל צלולוז או בדיקת CFU, המסייעת לזהות ולספור את מספר המושבות שנוצרו על ידי תאים לוקמיים בתגובה לטיפול בתרכובות אנטי-סרטניות.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מבחני יחידות יוצרות מושבה

  1. הפשירו את המתילצלולוז עם ציטוקינים לעכבר בטמפרטורת החדר למשך 1-2 שעות. Aliquot 3 מ"ל של מתילצלולוז בצינור FACS באמצעות מזרק 5 מ"ל ללא מחט. מיין את התאים החיוביים ל- YFP בממיין תאים.
  2. סובב את התאים כלפי מטה והשהה את הגלולה במדיה המלאה של IMDM. ספרו את התאים שיש לצפות ודללו אותם כדי לקבל 5,000 תאים חיוביים ל-YFP ב-100 מיקרוליטר של מדיה מלאה של IMDM.
  3. הוסף 100 μL של תרחיף התא המכיל 5,000 תאים חיוביים YFP ואת המעכבים המתאימים ל 3 מ"ל של מתילצלולוז. מערבלים על גבוה כדי לערבב אותו במשך 10-30 שניות.
  4. לאחר שרוב בועות האוויר ברחו, השתמש מזרק 1 מ"ל כדי צלחת 1 מ"ל של מדיה בשלושה לוחות משכפלים 3 ס"מ על ידי הוצאת המדיה בצד אחד והטיה איטית של הצלחת בתנועה סיבובית כדי להתפשט באופן שווה.
  5. הריכוז הסופי של המעכבים לשימוש הוא אימטיניב ב-3 מיקרומטר, DFC ב-0.2 מיקרומטר ו-BCI ב-0.5 מיקרומטר, לבד או בשילובים. במידת הצורך, מחק c-Fos על ידי ציפוי התאים עם 4-hydroxytamoxifen (1 מיקרוגרם / מ"ל) הוסיף מתילצלולוז.
  6. לאחר הציפוי, מניחים את הצלחות בצלחת פטרי גדולה עם צלחת פתוחה אחת המכילה 2 מ"ל מים סטריליים באמצע. מכסים את צלחת הפטרי הגדולה ודגרים בזהירות באינקובטור 37°C, 5% CO2. רשום את מספרי המושבות לאחר שבוע של ציפוי על ידי ספירת המספר הכולל של מושבות תחת מיקרוסקופ.
  7. נתח כמה מושבות מלוחות מתאימים למחיקת c-Fos על ידי PCR. אספו את המושבות על ידי מציצתן עם קצה P1000. עקרו את התאים ב-500 מיקרוליטר של 1x PBS על ידי שטיפת הקצה ב-PBS מספר פעמים. סובבו את תרחיף התא במהירות של 6,000 x גרם למשך דקה אחת וחלצו את הדנ"א מכדורית התא באמצעות ערכת בידוד DNA גנומית.
  8. השתמש ב- DNA הגנומי עבור PCR באמצעות הפריימרים mFos-FP3 ו- mFos-RP5. נתח את מוצרי ה- PCR על ג'ל אגרוז 2% ותמונה באמצעות מערכת תיעוד ג'ל.
  9. להצגה גרפית של המושבות, הכתימו את המושבות, באמצעות Iodonitrotetrazolium כלוריד. להמיס 10 מ"ג של כלוריד Iodonitrotetrazolium ב 10 מ"ל של מים כדי לקבל פתרון 1 מ"ג / מ"ל. פילטר את התמיסה באמצעות מנעול Luer עם מסנן 0.2 מיקרומטר המחובר למזרק 10 מ"ל בתנאים סטריליים במכסה מנוע של תרבית רקמות.
  10. במכסה המנוע של תרבית הרקמה, הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה סביב צלחת CPU; היזהרו לא להחליק או להפריע למושבות. לדגור על הצלחות למשך הלילה באינקובטור תרבית תאים של 37°C, 5% CO2. המושבות יהפכו לחום אדמדם כהה. בעזרת רקע לבן במכסה המנוע של תרבית הרקמה הסטרילית, צלמו את צלחת ה-CFU המוכתמת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IMDMCellgro (קורנינג)15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (מתילצלולוז עבור CFU עכבר)תאי גזע3434
4-הידרוקסיטמוקסיפןסיגמאH6278
רקומביננטי מורין SCFפרוספקטCYT-275
רקומביננטי Murine Flt3-ליגנדפרוספקטCYT-340
רקומביננטי מורין IL-6פרוספקטCYT-350
רקומביננטי מורין IL-7פפרוטק217-17
DFCמעבדות LKT בע"מD3420
ממשק מוח-מחשבChemzon סיינטיפיקNZ-06-195
אימטיניבLC LaboratorI-5508
1x PBSCellgro (קורנינג)21-040-CV
1/2 סמ"ק Lo-Dose U-100 מזרק אינסולין 28 G1/2בקטון דיקינסון329461
יודוניטרוטטראזוליום כלורידסיגמאI10406
מכשירים
חממת CO2 סדרת NAPCO 8000 WJתרמו-מדעי
סווינג דלי רוטור cetrifuge 5810Rאפנדורף
C-1000 מחזור תרמיביו-ראד
מערכת הדמיה ChemiDoc (מערכת הדמיה לג'לים וכתמים מערביים)ביו-ראד17001401
עכברים
ROSACreERT2מעבדת ג'קסון
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/תוצרת בית
ROSACreERT2/c-Fosfl/flתוצרת בית

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CFU

מאמרים קשורים